[发明专利]L-丙氨酸的制备方法及其应用

说明书

本发明属酶工程领域，具体说是一种利用德阿昆哈假单孢菌的上佳的培养基配方在气汁式发酵罐培养，获得具有高产量、高活力L-天门冬氨酸-β-脱羧酶，从而制备L-丙氨酸。

目前，我国生产L-丙氨酸的水平较低、产量较少，产品主要靠进口，原因在于目前国际上生产L-丙氨酸的两种主要技术，即固定化酶法和游离酶法在国内尚未成熟，固定化酶法生产L-丙氨酸尚在小试开发阶段，而游离酶法在我国少数厂家正在运用，但是突出的问题是酶活较低，酶失活较快，所以造成反应速度慢，生产效率低，成本高，不能大规模地工业化生产。日本在1982年固定化酶法生产L-丙氨酸进行了工业化生产，但由于底物抑制决定了转化液含L-丙氨酸低（80g/l），而提取的成本是与浓度成正比的，所以生产的成本很高，销价为130000日元/公斤，从而抑制了其市场及工业化规模。八十年末以来，日本寺沢真人、原良昭一等人在游离酶法生产L-丙氨酸技术上做了大量的研究，获得了突破，从而使丙氨酸的含量提高到88～90g/l。但是如用于工业生产，仍存在着以下不足：首先，虽然它的初始酶活较高（即8～24h能转化L-天门冬氨酸30w/v%），但是其酶活力的持久性差，从文献上看，其总的L-天门冬氨酸的转化量不超过30w/v%，所以单位酶源的生产效率低;其次，对于生物产品来说，一大部分的产品成本来自于后提取，而后提取的成本与目的产物的浓度是成反比的，即目的产物的浓度提高10倍，提取成本就降低10倍，所以低目的产物浓度势必带来较高的提取成本，制约了产品的工业化进程。

本发明的目的之一在于避免上述现有技术中的不足之处而提供一种对能有效产L-天门冬氨酸-β-脱羧酶的德阿昆哈假单孢菌的培养基进行筛选，从而获得高产量、高酶活的发酵液，并以此为酶源，制备L-丙氨酸。

本发明的目的之二在于用制备的L-丙氨酸生产V_B6。

本发明的目的可以通过以下措施来达：

本发明所用的微生物，可用含有L-天门冬氨酸-β-脱羧酶的德阿德昆哈假单孢菌（Pseudonomas dacunhae）。

本发明的酶源可直接使用P.dacunhae细菌的培养液。

本发明所用的前体L-天门冬氨酸是通过固定化大肠杆菌将富马酸转化而制得的。

本发明对在培养p.dacunhae时的培养基的碳源并没有特别的限定，可以使用富马酸、琥珀酸、苹果酸、谷氨酸、L-羟脯氨酸、葡萄糖等，其中以富马酸最为合适。作为培养基的氮源，使用氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素等无机盐，也可以使用胱氨酸、酵母膏、玉米浆、酪蛋白水解液、蛋白胨、牛肉膏等有机营养物质，其中无机氮源用氨较为合适，有机氮源经严格筛选，认为，蛋白胨、酵母膏、玉米浆对产酶活影响很大，而且混合使用效果更佳。

P.dacunhae培养是在通气循环或振荡的条件下进行，培养温度20℃～45℃，PH在6～10之间，培养时间为1～3天。

L-天门冬氨酸转化为L-丙氨酸是在20℃～60℃下进行的，最佳温度在30℃～50℃，PH通过酸调整在4～10之间，最佳值在5～8之间。

实施例1

钭面培养基：蛋白胨（重量百分比、下同）0.8～2.0%，酵母膏0.5～1.0%，牛肉膏0.5～1.0%，琼脂2%，PH7.0。

茄子瓶培养基：同上。

摇瓶培养基：富马酸铵0.2～2.0%，富马酸钠1.0～1.5%，蛋白胨0.8～2.0%，玉米浆0.55～2.4%，酵母膏0.2～1.2%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.005%，PH7.0。

发酵培养基：同上。

操作步骤：

将纯化过的P.dacunhae在25℃～37℃3钭面培养基中培养24h～30h，增殖;然后接一环此种子于茄子瓶20℃～40℃培养20h～40h;接1～4环茄子瓶种子于摇瓶培养基中，20℃～40℃培养20h～4h，摇床转速为50～300rpm;摇得100～300ml种子液，后在火焰接种于1500ml的发酵培养基中，20℃～40℃，通风0.1～1vvm，培养20h～40h，获得酶源;加L-天门冬氨酸于酶源中，4天消耗1800gL-天门冬氨酸，即120%（w/v），最终8天消耗L-天门冬氨酸220%（w/v）。

实施例2

钭面培养基：同实施例1之钭面培养基内容。

茄子瓶培养基：同钭面培养基内容。

摇瓶培养基：同实施例1之摇瓶培养基内容。

发酵培养基：同摇瓶培养基内容。

操作步骤：