[发明专利]一种新型溶栓药物及其制备

说明书

本发明涉及一种新型溶血栓药物及其制备方法。

尖吻蝮蛇毒中提取的纤维蛋白（原）溶解酶可降解血栓的主要成分纤维蛋白。目前报道的该酶仅作用于纤维蛋白原的α（A）链，而对β（B）链无作用（l.Ouyang  C，Huang  T-F.Purification  and  characterization  of  the  fibrinolytic  principle  of  Agkistrodon  acutus  venom.Biochim  Biophys  Acta  1976;439：146-53.2.Ouyang  C，Huang  T-F.The  properties  of  the  purified  fibrinolytic  principle  from  Agkistrodon  acutus  snake  venom.Toxicon  1977;15：161-7）。

尿激酶也是一个溶血栓剂，有人将尿激酶与抗人纤维蛋白单克隆抗体连接，制成单抗导向溶血栓剂，其纤溶效率比单纯尿激酶增加100倍（Bode  C，et  al.Antibody-directed  urokinase：a  specific  fibrinolytic  agent，Science  1985;229：765）。但是尿激酶价格昂贵。

本发明的目的是从蛇毒中得到一种新的纤维蛋白（原）溶解酶，并将此酶与抗人纤维蛋白单克隆抗体共价连接，制成单抗导向蛇毒溶血栓剂。

本发明从尖吻蝮蛇毒中得到一个对纤维蛋白原的α（A）和β（B）链均有降解作用的酶，分子量为25000～28000，等电点为8.00～9.00。并从含有抗人纤维蛋白β链N-端七肽单克隆抗体的小鼠腹水中亲和层析提纯该单克隆抗体。将上述纤维蛋白（原）溶解酶与双功能交连剂N-琥珀酰亚胺基3-（2-吡啶二硫基）丙酸酯（简称SPDP，下同）连接，再与经巯基修饰的单克隆抗体连接，最后得到纤维蛋白（原）溶解酶与抗人纤维蛋白β-链N-端七肽单克隆抗体的连接物。

本发明的主要优点是，所得到的溶栓药物其体外溶解血浆凝块活力较单纯纤维蛋白（原）溶解酶高，特异性好。与国外实验室现有的尿激酶抗体导向溶血栓剂相比，本发明所得到的溶血栓剂成本低，原料易得，更具临床应用价值。

实施例：

1  纤维蛋白（原）溶解酶的鉴定：

分子量测定：采用十二烷基硫酸钠（简称SDS，下同）-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。凝胶浓度12.5%，照常规方法电泳，标准蛋白采用Pharmacia公司电泳分子量测定试剂盒。测得纤维蛋白（原）溶解酶的分子量为26800。

等电点测定：采用等电聚焦电泳法。照常规方法进行等电聚焦电泳。电泳完毕，以1厘米为间隔，测量电泳胶从阳极到阴极各点的pH值，绘制pH梯度曲线，从曲线求出纤维蛋白（原）溶解酶的等电点。测得纤维蛋白（原）溶解酶的等电点为8.65。

对纤维蛋白的溶解方式：将纤维蛋白（原）溶解酶与纤维蛋白凝块在37℃反应，取反应液作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶浓度为12.5%。反应15分钟后，纤维蛋白的α亚基全部降解，反应60分钟后，β亚基大部分降解。

对纤维蛋白原的溶解方式：将纤维蛋白（原）溶解酶与纤原在37℃反应，取反应液作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶浓度为7.5%。反应15分钟后，纤维蛋白原的α亚基全部降解。60分钟后，β亚基大部分降解。

2  抗人纤维蛋白β链N-端七肽单克隆抗体与纤维蛋白（原）溶解酶连接物的制备：

抗纤维蛋白β链N-端七肽单克隆抗体的纯化：取小鼠腹水5毫升，用0.45μ膜过滤。将滤液加于用0.1M  pH8.0的磷酸缓冲液平衡好的蛋白-A亲和层析柱上，用相同缓冲液洗脱至280nm的吸光度＜0.01，改用0.1M，pH3.5的柠檬酸钠洗脱（洗脱组分用2M  Tris-Hcl  pH6.0，含0.15M  Nacl的溶液中和）。将收集组分对0.005M  pH8.0的磷酸缓冲液透析24hr，测抗体含量，冰干备用。

抗纤维蛋白β链N-端七肽单克隆抗体与纤维蛋白（原）溶解酶的连接：

纤维蛋白（原）溶解酶-SPDP连接物的制备：取纤维蛋白（原）溶解酶8毫克，溶于1毫升pH7.4的磷酸钠溶液中，加入20倍的SPDP无水乙醇溶液，室温搅拌25分钟，反应液对pH7.4的磷酸钠溶液（含0.2M精氨酸，0.01%Tween  80）透析12hr。