[发明专利]能够在沙门氏疫苗菌株表面表达酸免疫疟疾抗原的重组表达载体

说明书

本发明涉及新的重组表达载体，它能够在沙门氏疫苗菌株表面表达疟疾抗原HRPⅡ或SERP的致免疫肽。本发明还涉及含有该沙门氏菌并在通过口服接种后诱导哺乳动物体液免疫应答的疫苗。

疟疾抗原HRPⅡ和SEPR已在下列文献中进行过特征鉴定：EP-A2  0  315  085，Wellems  and  Howard，Proc.Natl，Acad.Sci.USA  83（1986），6065-6069，Knapp等人，Behring  Res.Commun.82（1988），349-359，EP-A1  0  283  882，Knapp等人，Mol.Biochem.Paras.32（1989），73-84，以及Higgins等人，Nature  340（1989），604。虽然部分上述文献也公开过含有该抗原或其免疫活性部分的疫苗，但仍然需要提供一种适于诱发具有保护作用且可靠的体液免疫反应以对付引起疟疾的原生动物如恶性疟原虫（P.falciparum）的改良疫苗。

在DE-A38  28  666和EP-A0357208中公开了可作为活疫苗应用的被转化的细菌菌株。Hackett，Vaccine  8（1990），5-11总结了有关沙门氏菌疫苗领域的现有技术状况。

构成本发明的技术问题是提供遗传工程生产的沙门氏菌株，它适于在口服后通过诱导高水平的体液免疫应答而产生对疟疾的保护性和可靠的预防作用。

以上技术问题是通过提供权利要求书中所定义的实施方案而得以解决的。

因此，本发明提供了包括以下成分的重组表达载体：

（a）一个强诱导启动子;

（b）一个编码革兰氏阴性细菌杂化的OmpA蛋白的杂化基因;

（c）一个定位于OmpA基因中相应在OmpA蛋白的第三外环的克隆位点;和

（d）一个DNA序列，即

（da）被整体插入克隆位点（c），

（db）编码能够在哺乳动物中诱发体液免疫应答的疟疾抗原HRPⅡ或SERP或其一部分，该疟疾抗原最好得自恶性疟原虫。

术语“强诱导启动子”是指在转录水平上对位于其下游的序列所编码的蛋白质的表达具有高效控制作用的一个核苷酸序列，它可通过温度转移或加入化学物质（如IPTG）而被诱发。该强诱导启动子的一个优选实例是受控于lac阻遏物的tac启动子。

术语“克隆位点”是指含有限制性内切酶切割位点、适于整合所需DNA片段的一个DNA序列。

术语“在哺乳动物中能够诱导体液免疫应答反应的疟疾抗原HRPⅡ或SERP的一部分”是指对生产疫苗有用的HRPⅡ或SERP的区域。这种区域本领域熟练技术人员按照传统方法可确定，例如应用传统的计算机程序（可通过实验证实T-细胞抗原决定基）。对于SERP，这种区域最好是与SH蛋白酶同源的区域，或含有T-细胞抗原决定基。在本文中术语“SH蛋白酶”是指在其活性部位带有必需的半胱氨酸残基的蛋白酶。术语“T-细胞抗原决定基”是指刺激由T-淋巴细胞介导的细胞免疫应答的一个氨基酸序列。

由本发明的重组表达型载体编码的融合蛋白在表达后被转运至细菌细胞壁，并按使疟疾抗原HRPⅡ或SERP或其所说部分出现于外部环境的方式插入到细胞壁中。该表现方式通过使暴露于该转化细菌宿主的哺乳动物免疫系统识别该疟疾抗原并产物保护性免疫应答而发挥作用。该疟疾抗原最好以与其天然形式相似的构象存在于本发明的转化细菌宿主的表面。

在本发明的一优选实施方案中，重组表达型载体还包括：

（ca）被插入到所说克隆位点（c）的一个编码流感血凝素（HA）蛋白1-48氨基酸和279-515氨基酸的DNA序列，在编码HA蛋白的第46个氨基酸处含有第一克隆位点，在编码HA蛋白的第400氨基酸处含有第二克隆位点，其中该DNA序列（d）被插入到DNA序列（ca）的至少一个所说的克隆位点。

在本发明的一个更优选实施方案中，所说的部分HRPⅡ由存在于重组表达载体pOmpA-6中的189个氨基酸组成，该载体的限制性内切酶的酶切图谱示于图1。

在本发明的另一优选实施方案中，重组表达型载体编码由177个氨基酸组成的HRPⅡ的部分，它存在于具有图1所示限制性酶切图谱的重组表达型载体pOmpA-3中。

在本发明重组表达型载体的另一优选实施方案中，所说的SERP的部分含有一个与SH蛋白酶同源的区域。

在一最佳实施方案中，与SH蛋白酶有同源区域含有SERP的442-892、573-595或745-787位氨基酸。