[发明专利]表达酶原形式的人蛋白C的载体和化合物

说明书

本发明涉及编码酶原形式人蛋白C的新DNA化合物和重组DNA克隆载体。这类酶原可以在体内仅由凝血酶以临床意义上的速度活化，并且比天然蛋白C酶原更易受凝血酶/凝血调变蛋白（thrombomodulin）的活化。所述表达载体提供了一种在重组寄主细胞中表达这类人蛋白C酶原的简单而有效的手段。天然人蛋白C酶原的活化需要用高水平的凝血酶、或凝血酶和凝血调变蛋白、或其它昂贵的酶处理。本发明提供一种产生酶原形式人蛋白C的方法，这种酶原形式的人蛋白C是凝血酶更好的底物，它们在低水平的凝血酶或凝血酶/凝血调变蛋白或其它酶的存在下便可活化。最重要的是，本发明的酶原形式人蛋白C即使在生理Ca²⁺存在下也可被凝血酶活化，所述生理Ca²⁺是凝血酶活化天然蛋白C酶原的抑制剂。所述新酶原形式的人蛋白C在活化肽区域的氨基酸残基顺序不同于本领域已知的那些，所述活化肽从酶原形式中除去便产生活化的人蛋白C。这些新型酶原形式的人蛋白C在治疗血液失调（包括血凝固）方面显示了特别的优越性。

蛋白C是一种依赖于维生素K的血浆蛋白，在控制止血作用方面具有重大的生理作用。蛋白C作为一个无活性分子被合成，此处称之为“初生蛋白C”。初生蛋白C经复杂的处理，产生很多不同的无活性分子。如同下面所作出的更加充分的叙述。此处将蛋白C的无活性分泌形式称作为“酶原蛋白C”。在血液中，通过涉及凝血调变蛋白-凝血酶复合物的反应，发生蛋白C的活化作用。经活化的蛋白C及其辅助因子蛋白S一起，是一种具有重要生理学意义的抗凝剂。活化的蛋白C能防止血管内血栓症，并控制原有血块的扩大。活化形式蛋白C的作用机理以及无活性酶原活化成活性蛋白酶的机理在近些年内已被阐明（文献综述见J.E.Gardiner  and  J.H.Griffin，Progress  in  Hematology，Vol.ⅩⅢ，PP.265-278，ed.Elmer  B.Brown，Grune  and  Stratton，Inc，1983和Esmon，N.L.，1989，Prog.Hemost.Thromb.9∶29-55）。

蛋白C的活化作用涉及凝血酶、凝血链锁反应最终的丝氨酸蛋白酶、以及称之为凝血调变蛋白的与内皮细胞膜相联的糖蛋白。凝血调变蛋白与凝血酶形成一个牢固紧密的化学计量复合物。当凝血调变蛋白与凝血酶复合时，显著地改变了凝血酶的功能性质。在正常情况下，凝血酶将纤维蛋白原凝成块，使血小板活化，并将凝血因子Ⅴ和Ⅷ转变成它们的活化形式Ⅴa和Ⅷa。最后，凝血酶使蛋白C活化，但是很慢，效能不高，而且该活化作用进一步受到生理Ca²⁺的抑制。相反，与凝血调变蛋白复合的凝血酶并不使纤维蛋白原凝成块，不使血小板活化，或不将凝血因子Ⅴ和Ⅷ转变成它们的活化相应物Ⅴa和Ⅷa，但是在生理Ca²⁺的存在下却成为非常有效的蛋白C酶原的活化剂。通过凝血调变蛋白-凝血酶活化蛋白C酶原的速率常数比单独用凝血酶时高1000倍以上。

为了了解活化蛋白C如何下调血液凝固，下面对凝固酶系统进行简略的叙述。最好把凝固系统作为包括各酶原依次连续活化成为各种活性的丝氨酸蛋白酶的链锁反应来考察。该链锁反应最终产生凝血酶，它经过有限的蛋白分解，将血浆纤维蛋白原转变成不溶性的凝胶纤维蛋白。在凝固链锁反应中，两件关键的事情是：一、通过凝血因子Ⅸa使凝血因子Ⅹ转变成Ⅹa;二、通过凝血因子Ⅹa，使凝血酶原转变成凝血酶。这两种反应在细胞表面发生，最显著地在血小板表面，同时两种反应均需辅助因子。主要的辅助因子（因子Ⅴ和Ⅷ）在系统中作为相应的无活性前体流通，但当开头几个凝血酶分子形成时，凝血酶便返回来通过有限的蛋白分解使辅助因子活化。被活化的辅助因子Ⅴa和Ⅷa加速了凝血酶原转变成凝血酶，也加速了因子Ⅹ转变成因子Ⅹa，速率大约提高5个数量级。活化蛋白C优先作用于蛋白的降解和水解，并不可逆地破坏凝血辅助因子Ⅴa和Ⅷa（无活性凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活化形式）。反之，凝血因子Ⅴ和Ⅷ在体内对活化的蛋白C来说是非常差的底物。

活化蛋白C的一个重要辅助因子是蛋白S，它是另一种依赖维生素K的血浆蛋白。蛋白S使活化蛋白C介导的因子Ⅴa和Ⅷa的水解增加25倍。