[发明专利]微生物发酵生产多糖溶液

说明书

本发明为用微生物发酵生产多糖的方法。

微生物多糖溶液具有高粘度，假塑性，对广泛的pH，温度，二价离子和剪切稀释作用等比较稳定，且可为微生物降解而不污染环境等优点，广泛用于石油，轻纺，化工等行业，而最大的用量寓于石油工业中作为钻井泥浆、压裂液等的添加剂和提高采油的流度控制剂等。如美国80年代初发展了利用黄单胞菌胶（Xan-than  gum）调整油田注水剖面技术（Avery  M.R等，SPE  14114，1986）。许多微生物具有合成胞外多糖的能力。目前国内外已工业生产的多糖，如黄单胞菌胶、右旋糖酐、茁霉多糖等，多以碳水化合物为发酵碳源。例如欧洲专利EP-189959号公布了一种制备多糖溶液的方法，加入纤维素和纤维素酶到发酵培养基中，所生产的多糖可用于提高石油的采油率。但用碳水化合物（如葡萄糖，蔗糖，淀粉）有与民争粮之虞。王修垣等用产粘短杆菌Brevibacterium  viscogenes  n.SP  74-230以烃类（原油或石蜡）为碳源产生一种胞外多糖（王修垣等“一种新的微生物胞外多糖”《中国科学》B辑1984，（9）：799-804，1984），在石油工业中有应用前景，可作为驱油添加剂，提高采油率，亦可作为钻井泥浆添加剂。用烃为碳源生产微生物多糖较用碳水化合物成本低，但开始启动发酵较慢。

本发明的目的在于提供一种可就地生产，就地使用，减少碳水化合物的用量且发酵起动快，得到高粘度发酵液的微生物发酵生产多糖的工艺。

本发明用两种菌株混合发酵，所用的菌株之一为产粘短杆菌74-230（Brivibacterium Vescogenes n.SP.74-230）（王修垣等，微生物学报20（4）：345-350，1980），该菌株在中国科学院微生物研究所菌种保藏室保藏。本发明所用的另一菌株为野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）L₅或L₄（刘秀芳等“两株黄单胞菌多糖生产菌的鉴定”，《微生物学报》，待发表）。该菌株亦保藏在中国科学院微生物研究所菌种保藏室。该菌能利用碳水化合物产生多糖但不能利用烃类。本发明所用的碳源为烃类和碳水化合物混合碳源，烃类可以为原油，重液体石蜡或烃类混合物;碳水化合物可以为淀粉，葡萄糖，蔗糖。

本发明所用的固体种子培养基为，产粘短杆菌为营养琼脂，野油菜黄单胞菌为土豆汁琼脂。混合菌株液体种子培养基含有（克/升）：NaNO₃1.5，Na₂HPO₄·12H₂O 0.6，MgSO₄·7H₂O 0.5，酵母膏0.5，重液体石蜡和碳水化合物（淀粉，或蔗糖，或葡萄糖）各10.0，CaCl₂0.2，pH7.0-7.5。各取一试管琼脂斜面上生长良好的培养物制成县浮液，等量接种于上述液体培养基中。250ml三角瓶装50ml培养基，置28-30℃、220转/分的旋转摇床上培养48-72小时，作为种子液。亦可取试管斜面上生长良好的菌体分别涂布在克氏瓶内的营养琼脂和土豆汁琼脂表面上，于28-30℃培养2-3天，用其悬浮液作为种子。

用上述混合菌种种子液接种于混合底物培养基中，接种量为2-5%，起始pH为6.5-10，最好为7.0-8.5，搅拌转速为200-240转/分，发酵温度27-31℃，通气量1∶0.5-1.5。发酵培养基的组成为（克/升）：碱金属磷酸盐为0.5-4.0，最好为0.5-2.0;硝酸盐1.0-3.0，最好为1.5-2.0，酵母膏0.5-2.5，最好为1.5-2.0;硫酸镁0.1-1.0，最好为0.2-0.5;钙盐0.06-0.5，最好为0.3-0.5;烃类和碳水化合物可以1-5%的任意比例混合，而以1.5-2.5∶2.5∶1.5%为最适。碱金属磷酸盐可以为Na₂HPO₄，KH₂PO₄，NaH₂PO₄，K₂HPO₄，钙盐可以为CaCl₂，CaCO₃，硝酸盐可以为NaNO₃，KNO₃，NH₄NO₃。发酵时间72-96小时。