[发明专利]转基因生物和细胞及其制备方法

说明书

本申请是1989年6月23日提交的07/730，557号申请的后续部分，而后者又是1988年12月21日提交的07/287，713号申请的后续部分。

本发明涉及单细胞和多细胞的转基因生物（动物、植物和微生物）和生产这些生物的方法。

遗传物质由一个细胞向另一细胞的转移可用来产生表达外源遗传特性的转基因动物，因此最近引起了广泛注意。Scangos等人对基因转移曾进行过综述，见Adv.Gen.24：285，1987;Houseman和Nelson也进行过综述，“利用中期染色体转移测定哺乳动物基因图”，见Kucherlapati编《基因转移》PP95-115，Plenum        Press，纽约，1986。

Leder和Stewart的4，736，866号美国专利公开了转基因哺乳动物，为了检测化学药品对哺乳动物的致癌作用，这些动物的基因组中掺入有与外来致癌基因相关的DNA。用于制备这些转基因哺乳动物的部分方法在Wagner和Hoppe的4，873，191号美国专利和Proc.Nat.Acad.Sci.USA78：5016，1981中已经公开。

外源基因向其他物种的转移还可用于向易得病物种转移疾病抗性因子，和通过植物、动物和微生物以及培养植物、动物和微生物细胞生产商业上有用的化合物。虽然有几种方法可用来将DNA从一个细胞转移到另一个细胞，但这些方法缺乏可预见的和/或有效的外源DNA向受体基因组的掺入，并且所要转移的DNA大小受到严格限制。这些都是现有技术的缺陷，例如见4，873，191号美国专利。

直接向受精卵的前核内显微注射DNA是一种广为使用的将DNA从一个细胞向另一个细胞转移的方法。这种技术是，用一个非常小的移液管，将外源DNA片段注射到受精卵母细胞的前核中，如小鼠卵母细胞。所注射的DNA一般是一种结合在质粒克隆载体中的重组DNA。

在注射之前，通常要用限制性核酸内切酶切割含有外源DNA的质粒，以使它们线性化或切下一个重组插段。然后，可将DNA和载体DNA一起注射，或者将含有该DNA片段的插段分离后再注射。常常是向每个前核内注射1到几百个外源DNA拷贝。注射DNA之后，将胚胎转移到一个假孕雌性动物中并发育到足孕。

典型地是，外源DNA的整合发生于受体细胞基因组内某一位点，但某些转基因生物（如转基因小鼠）可含有多个整合位点。对于DNA整合机理仍没有真正研究清楚。可以对这种转基因动物中的外源DNA进行表达，而且常常可以将这种外源DNA通过该种系传递给后代。

4，736，866号和4，873，191号美国专利公开了通过这种方法制备的转基因非人类哺乳动物。在4，736，866号美国专利中，将含有小鼠myc基因或S107浆细胞瘤myc基因的质粒注射到受精单细胞小鼠卵的雄性前核中。已知可以使这种myc基因活化以增加动物体内肿瘤，尤其是恶性肿瘤的发生。

每个前核要注射大约500个线性化的质粒拷贝。然后将已注射的卵转移到假孕雌性动物中发育至足孕。含有myc致癌基因的小鼠可用于测定一种怀疑致癌的物质，方法是将这些动物暴露于可疑致癌物，并且测定赘生物的生长作为致癌性的标志。

虽然这种向受精卵的前核内注射重组DNA的方法是有效的，但这种方法只能有效地转移较少的DNA片段，通常小于100千碱基（kb）的连续DNA。这种大小限制可能是因为在受体细胞中存在有内源核酸酶，可引起注射的DNA降解。另外，机械剪切引起的DNA断裂也限制使DNA大分子通过小吸管头部孔的可行性。

同样，通过磷酸钙或多阳离子沉淀的DNA而将DNA转移到细胞中，也只可转移较少的DNA连续片段，其大小一般少于100kb。运用这种不同的方法，还有可能会因为内源核酸酶引起的DNA降解而限制此方法中可插入DNA分子的大小。

如果想要转移由很大的基因编码的遗传特性，如杜兴肌营养不良综合症的营养障碍基因，或视网膜神经胶质瘤的Rb基因，或者转移那些由多基因复合体编码的遗传特性，如人免疫球蛋白复合体和组织相容性座位时，前面的DNA显微注射和磷酸钙/多阳离子DNA沉淀法都表现出非常显著的障碍。人免疫球蛋白复合体含有那些来自由非连续DNA片段组成的基因组，这些非连续片段的遗传座位相距很远。

因此，为了将表达完整人免疫球蛋白基因组的能力转移给受体细胞或生物，则必须转移编码整个基因组的成千上万个千碱基的DNA。到目前为止，由于现有的DNA转移法受到分子大小的限制，这种转移大分子基因的方法尚未成为可能。