[发明专利]玉米品种、纯度鉴定方法

说明书

本发明为一种鉴定玉米品种及其纯度的方法，特别是关于对玉米代谢蛋白的提取方法及对提取蛋白鉴定方法的改进。国际分类号：C07K。

玉米是主要的农作物之一，玉米品种的优劣是决定玉米高产的首要因素。在生产中，不但要保证品种的优良性状，而且要保证良种的纯度。然而玉米良种在杂交制种过程中，由于去雄不及时等因素，易将自交系混入杂交种中去，这样会对玉米造成大幅度减产;有些不法经营者将假种子掺入良种，更会给农业生产造成大的危害。所以，玉米品种及其品种的纯度是重要的商业流通指标。

目前对于玉米品种及其纯度鉴定采用的主要方法有：

（1）田间形态鉴定法：根据玉米的苗期、花期和成熟期的形态来鉴定。该方法准确度高，但费时、费地，关键问题是因所需时间太长，不可能满足生产的需要。

（2）同功酶电泳法：根据玉米同功酶的电泳谱带来区分品种。该方法测定周期较长，而且同功酶谱带太少、难以鉴定品种，鉴定准确度差。另外不同的同功酶有其特定的染色方法，在生产中不适用。

（3）醇溶蛋白等电聚焦电泳法：该方法准确度高，但由于成本太高，很难满足生产需要。

综上所述，现行的鉴定方法，有的准确度较差、有的费时费工、有的价格昂贵，都不适于用于制种管理、种子流通管理。如何采用可靠的分析方法，克服上述分析方法的缺陷快速准确地鉴定玉米品种及品种的纯度，就成为本发明的目的。

本发明的依据是：玉米的遗传基因决定了玉米品种间的差异。即不同的品种具有不同的遗传基因，而玉米代谢蛋白的种类由遗传基因所控制合成，故每一种玉米品种均有特征的代谢蛋白谱带。根据蛋白谱带类型就可鉴定玉米品种及其品种的纯度。根据以上理论，为此进行了研究，结果表明，酸性条件下不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳能将玉米代谢蛋白成功地分成不同的蛋白带，每一品种均有其专一的蛋白谱，通过对蛋白谱的分析，可鉴定出玉米品种。采用GB3543-83方法进行取样，对样品采用本发明分析就可鉴定出玉米品种的纯度。另外，根据玉米杂交种和其亲本的蛋白谱带可清楚地分析其亲缘关系。

本发明是这样实现的：

1.将单粒玉米粉碎至粒度直径为1mm以下，放入1.5-5.0ml离心管中，加入提取液。提取液的配方是：0-4M氯化钠溶液，其中含有15-25%蔗糖和0.001-0.003%的甲基绿。玉米样品量∶提取液量＝1∶1-4，室温下提取0.5-4小时，间歇振荡4-6次。然后在3000-6000rpm离心5-20分钟，取上清液备用。

2.电泳胶制备：

设备：通用型电泳仪，垂直板电泳槽。

电泳中的凝胶系统采用酸性条件下的不连续聚 丙烯酰胺系统，配方如下表：

电泳缓冲液采用甘氨酸/乳酸系统，pH3.2-4.0。

制胶按一般电泳胶程序操作。

3.电泳：

成胶后，将提取液上清液上样，上样量5-30μl;电泳条件：正极接上槽，负极接下槽，采取稳压方式，电压400V，电泳时间1-3小时。电泳具体时间根据甲基绿跑到下方且将要跑出时停止。

4.染色：

电泳完毕，将胶取出，放入染色液中染色。染色液的配方为：8-12%三氯乙酸，其中含0.02-0.04%考马斯亮蓝R₂₅₀染色1-4小时，不需脱色，直接放置在白瓷砖上，即可观察到种子的特征谱带。

5.结果分析及处理：

根据蛋白谱带的多少及各谱带的相对迁移率可对玉米品种进行鉴定。选用一固定品种，利用该品种的特征谱带对比计算其它品种各蛋白的谱带的相对迁移率，即可消除各板间的误差。对于未知玉米的种子，只要将根据上述分析而得到的蛋白谱带，比照各种玉米品种的标准谱带，即可鉴定出该种子为何种品种。

6.玉米品种纯度的鉴定：采用GB3543-83方法取样，对样品采取如本发明所述的方法分析，仔细观察样品的蛋白谱带，计算出相同谱带样品占参试样品的百分比。即得纯度。

图1.不同地区种植的M017蛋白电泳谱带。

1.陕西    2.河南登封    3.辽宁丹东    4.河南开封    5.河南新野    6.河南南阳    7.河南淇县    8.河南许昌

从M017的代谢蛋白带可见，同一品种在不同环境下种植，谱带完全一样，说明代谢蛋白只和遗传基因相关，而和种植环境无关。

图2几种杂交种和其亲本自交系的电泳谱带