[其他]编码蛋白水解酶之基因的分子克隆及表达

说明书

本发明涉及增加丝氨酸蛋白酶生产的新的杆菌菌株及其生产方法。更具体地说，本发明涉及在杆菌属菌株中引入和稳定维持来源于某嗜碱杆菌菌株的、编码高碱性蛋白水解酶的DNA序列，借以放大所说的DNA序列，并从而显著提高所说酶之生产水平的方法。

芽孢杆菌被广泛用于生产工业上重要的酶类，例如α淀粉酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶或丝氨酸蛋白酶（参见Debabov，“The    Industrial    Use    of    Bacilli”，in：The    Molecular    Biology    of    Bacilli，Acad    Press，New    York，1982）。

枯草杆菌蛋白酶为细菌丝氨酸蛋白酶，它们通常用于裂解蛋白质或肽类的内部肽键。这些酶可以从许多原核生物体中得到，例如由革兰氏阴性菌（如沙雷氏菌或假单孢菌）及革兰氏阳性菌（如细球菌和芽孢杆菌）中得到。

有价值的工业枯草杆菌蛋白酶是用各种芽孢杆菌如枯草杆菌（B.subtilis）、地衣形芽孢杆菌（B.licheniformis）、淀粉液化杆菌（B.amyloliquefaciens）、嗜碱杆菌（B.alcalophilus）及其他杆菌生产的（参见美国专利3674643、3723250和4480043号）。一种重要的枯草杆菌蛋白酶叫作“高碱性蛋白水解酶”，它是用工业杆菌新种PB92菌株生产的，该菌株已特别记载于美国再版专利30602号中。

高碱性蛋白水解酶类，是在碱性介质中具有高度活性的丝氨酸蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶。更具体地说，高碱性蛋白酶在PH大于大约9时具有最佳活性，而且在PH约11或更高时至少可保留80%的最佳活性。高碱性蛋白酶通常是由能够在碱性PH条件下生长的某些芽孢杆菌菌株生产的（如美国专利3723250、4480037号及美国再版专利30602号中所述）。这些生产高碱性蛋白酶的芽孢杆菌在分类学上尚未明确，本说明书中将其称为嗜碱芽孢杆菌菌株。

利用经典遗传学技术，例如突变及继后的选择以及近代分子生物学技术可以改进芽孢杆菌酶的生产。本发明即属于后一可能性的具体实例。

采用分子生物学序列以改善酶的生产的方法，大都涉及克隆编码所说酶的基因。已经成功地克隆出芽孢杆菌胞外酶的几种基因，为淀粉液化芽孢杆菌（B，amyloliquefaciens）的α淀粉酶基因（Palva    et    al.，Gene    15，43-51，1981）、地衣形芽孢杆菌的α淀粉酶基因（Ortlepp，Gene23，267，1983）、嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus）的α淀粉酶基因（Mielenz    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80，5975-5979，1983;欧洲专利申请（EPA）-0057976）和枯草杆菌的α淀粉酶基因（Yang    et    al，Nucleic    Acids    Res.11，237，1983）、枯草杆菌的果聚糖蔗糖酶基因（Gay    et    al.，J.Bacteriol.153，1424，1983）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Fuji    et    al.，J.Bacteriol.156，831，1983）、淀粉液化芽孢杆菌（Honjo    et    al.，J.Biotech.1，165，1984）和枯草杆菌（Yang    et    al.，J.Bacteriol.160，115，1984）的中性蛋白酶编码基因、枯草杆菌的丝氨酸蛋白酶或碱性蛋白酶编码基因（Wong    et    al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，1184，1984）、地衣形芽孢杆菌（Jacobs    et    al.，Nucleic    Acids    Res.13，8913，1985）和淀粉液化芽孢杆菌（Wells    et    al.，Nucleic    Acids    Res.11，7911，1983）的丝氨酸蛋白酶或碱性蛋白酶编码基因。