[其他]含谷胱甘肽S-转移酶基因的除莠剂耐性植物

说明书

本发明涉及用以转化植物的DNA重组技术的用途，其办法是对除莠剂进行解毒以将除莠剂耐性授予植物。更具体地说，本发明涉及DNA重组分子的构建及其用途，此DNA分子包括谷胱甘肽S转移酶（GST）基因，它在植物中表达后增加植物中GST的酶活性。

GST（EC2.5.1.18）是一类在非生物合成有机物解毒中所涉及的酶。这些酶普遍存在于大多数活的生物体中，这些生物体包括微生物、植物、昆虫和动物。这类酶中每种GST酶的性质是不同的，然而这类酶又的确呈现某种重迭的底物专一性，参见I.Arias和W.Jakoby（Raven    Press，New    York，1976）所编《谷胱甘肽：代谢及功能》中，Jakoby等人“鼠谷胱甘肽S-转移酶：结合及其物理性质;Reddy等人“不同个体羊肝GST的纯化和性质”，Archives    of    Biochem.and    Biophys.，224：87-101，1983。

在GST的这些功能中，人们特别感兴趣的是GST在谷胱甘肽与亲电子化合物的结合中所起的催化作用（Phytochemistry，21：2771-2781，1982，H.Rennenberg“高等植物中谷胱甘肽的代谢及其可能的生物学作用”;Meister和Tate“谷胱甘肽及其相应的ρ-谷氨酰化合物：生物合成和利用”，Ann.Rev.Biochem.，45：560-604，1976）。很多非生物合成有机物（包括除莠剂、杀虫剂和杀菌剂）都是亲电子化合物。在谷胱甘肽与化合物的亲电中心的连接中，谷胱甘肽的巯基与化合物的亲电中心反应。谷胱甘肽是作为一种亲核试剂与亲电化合物连接而起作用的。该连接是靠专一的GST酶催化的（Rennenberg，同上）。

对植物而言，此反应非常重要，因为它提供了非生物合成有机物的解毒机理。这种亲电子的非生物合成有机物的结合作用使它具有水溶性并因此对于植物是无毒的。

因此，最好是利用遗传工程技术增加谷胱甘肽S-转移酶在所说植物中的活性水平来培育一类除莠剂耐性植物。采用此法，即可能将除莠剂耐性授予植物。

本发明涉及DNA重组分子，它通过生产使除莠剂解毒的蛋白质将除莠剂耐性授予植物。已知的解毒作用的机理包括：GST催化的谷胱甘肽与亲电子化合物的结合、D-氨基酸与2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）的结合、磺酰脲的羟基化及其与碳水化合物的结合。更具体地说，本发明涉及用DNA重组分子转化的一类除莠剂耐性植物，该DNA分子编码的酶能使除莠剂解毒。确切地讲，本发明还涉及所说的DNA重组分子，它包括编码谷胱甘肽S-转移酶多肽的基因顺序，还涉及谷胱甘肽S-转移酶活性水平增加的、耐除莠剂的转移基因的植物细胞。本发明中，所说植物细胞是用谷胱甘肽S-转移酶基因转化的，它在表达或超表达后使植物具有除莠剂耐性。

本发明还涉及由此转化的植物细胞和其种子再生的植株，及其由此转移基因的植物细胞再生的植物的后代，包括突变体及变种的后代。

本发明还涉及嵌合基因构建体，该构建体含有谷胱甘肽S-转移酶基因、克隆载体和宿主，以及将除莠剂耐性授予植物的方法。

附图简介：

图1示出了测定Yb200的pGTR200cDNA插段顺序的战略，它是鼠肝谷胱甘肽S-转移酶基因。

图2所示为质粒pCIB710（一种大肠杆菌复制子），它包括CaMV35SDNA的转录启动子、终止子及外加的多聚腺苷酸信号。

图3所示为质粒pCIB12（一种大肠杆菌复制子）的构建，它所含的嵌合基因包括CaMV35S启动子（它与鼠谷胱甘肽S-转移酶cDNA基因相连接）、Yb200及CaMV终止子。

图4A为质粒pCIB14（一种广宿主复制子）的构建，它在T-DNA边界中含有两个嵌合基因，嵌合基因中含有CaMV35S启动子，它与鼠肝谷胱甘肽S-转移酶基因、Yb200、CaMV终止子及卡那霉素抗性基因、nos-neo-nos等相连接。

图4B所示为部分克隆通过活体重组方法的结合。

图4C为部分克隆通过体外连接法的结合。

图5所示为无转移基因的烟草叶片的典型的荧光诱导模型。所示上部曲线为叶片已吸收10^-5M莠去津48小时后的情形，下部曲线为仅用缓冲液抑制后的情形。

图6所示为pCIB14转移基因的烟草叶片吸收10^-5M莠去津48小时后荧光诱导的模型。该图表明了三类反应：（Ⅰ）对莠去津无解毒作用，顶部曲线;（Ⅱ）对莠去津的解毒作用明显，最下面的曲线;（Ⅲ）有一定程度的解毒作用，中间的曲线。