[发明专利]用载体转化骨髓瘤细胞生产肽的方法

说明书

本发明涉及应用遗传工程技术生产肽的方法、用于生产肽的重组质粒和用该重组质粒转化的动物细胞。

关于用转化动物细胞和培养转移基因接受体来生产肽已经作了各种尝试。其中的实例与近似的计算产率一并阐述如下。

1.BPV(牛乳头状瘤病毒)小鼠C127系统：人体IFN-γ基因(cDNA)，SV40早期启动子；3×10⁵单位/毫升(R.Fukunaga等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81，5086(1984))；

2.SV40-CV-1系统：人体IFN-β基因(cDNA)，SV40早期启动子；2×10⁴单位/毫升(D.Gheysen等，J.Mol.Appl.Genetics，1,305(1982))；

3.SV40-COS系统：人体胰岛素基因(cDNA)，SV40早期启动子(O.Laud等，J.Biol.Chem.，258，6043(1983))；

4.Eco-gpt-CHO系统：人体IFN-γ基因(cDNA)，SV40早期启动子；1×10⁴单位/毫升(T.Kadotani等，Seikagaku，56，915(1984))；和

5.dhfr-CHO系统：人体IFN-γ基因(cDNA)，SV40早期启动子；1×10⁵单位/毫升(S.Scahill等，Proc.Natl.Actl.Sci.USA，80，4654(1983))。

尽管这些方法中每个方法都有其特点，但每个方法仍然都不能令人满意，特别是在所需要的肽的产率方面更是如此。

在生产单克隆抗体肽方面，骨髓瘤已用作产生抗体的细胞，然而将他们用于生产其他肽方面至今仍无所知。

本发明涉及用转化的动物细胞，特别是骨髓瘤细胞生产肽的方法，包括转化细胞和培养转化细胞。在一实施例中，本发明尤其涉及生产所需肽的方法，包括用重组体质粒作为载体转化哺乳动物的细胞，该重组体质粒在所需肽的编码基因的5′端上游链和3′端下游链上都具有SV40早期启动子顺序，然后培养由此转化的哺乳动物细胞。

在另一实施例中，本发明涉及大量生产所需肽的方法，包括用重组体质粒作为载体转化骨髓瘤细胞，该重组体质粒在用于所需要肽编码基因的5′端上游链和3′端下游链上都具有SV40早期启动子顺序。

骨髓瘤细胞的优点在于，他们具有在体内和体外迅速生长的能力，他们具有高度合成蛋白质的能力(相对于IgG而言)；他们能够使细胞密度增至很高倍数。作为该实施例的一个显著特点，本发明通过将上述骨髓瘤细胞的有利特征与SV40启动子和强化因子强有力地表达出的增强效应相结合，可以成功地产生大量的肽。

此外，本发明涉及一种重组体质粒，该质粒具有处于用于合成所需肽的编码基因的5′端上游链及3′末端下游链上的SV40早期启动子顺序，并涉及用该重组体质粒转化的动物细胞。所述5′端上游和3′端下游的SV40早期启动子，如附图及实施例所示，前者存在于用于编码所需肽的基因的上游区内，后者存在于用于编码所需肽的基因的下游区内。

图1和图2：载体构建方案图。

图3和图4：显示DNA片段的限制图。

图5～12：显示所用各个质粒的粗糙型限制图。

将引入动物细胞的质粒加入到动物染色体DNA中并保持其稳定。基因产物即肽稳定地由转化细胞产生，而转化的细胞又能够长久地存活着。

不产生骨髓瘤细胞或不分泌(就IgG而言)骨髓瘤细胞的用途是能够避免IgG的污染，因此有利于所需的肽的纯化。此外，由于骨髓瘤细胞能够在动物，例如在小鼠的腹膜腔内增殖，所以基因产物(肽)预计可以作为副产品大量产生。

本发明的另一个特点就是使用带有位于所需肽(如IFN)编码异源基因的5′端上游链和3′端下游链两者上的SV40启动子，使基因产物的产率增加到大约10倍。

用作宿主细胞的细胞可以是上述的各种骨髓瘤细胞，例如小鼠、大鼠和人体的骨髓瘤细胞，其中从产品纯化的角度来看，非IgG产生的或非IgG分泌的细胞较为适宜。P3-X63-Ag8-U1(不分泌型)HGPRT^-、X63-Ag8-6.5.3(不产生型)HGPRT^-和SP2/0-Ag14(不产生型)HGPRT^-等细胞系都是大鼠骨髓瘤细胞系的例子，并已为大家熟知(Munemura编：《细胞培养手册》，Kodansha，东京，1982年；Iwasak-i等：《单克隆抗体》，Kodansha，东京，1982年)。