[其他]用“高聚物、盐、水”两相系统纯化酶制剂

说明书

本发明属酶制剂的提纯方法。

随着酶制剂发酵工业的迅速发展，发酵产品的分离纯化技术日显迫切需要，将发酵所得酶制剂应用于食品加工业之前，必须先将粗酶制品中所含的不符合卫生要求、有使人不愉快气味和色泽的种种杂质除去，方可应用。1977年前后，西德学者M.-R.Kula等人将水两相系统应用于酶制剂工业生产过程。他们采用葡聚糖、聚乙二醇、水所构成的两相系统，分离纯化了克雷伯氏肺炎菌（Klebsie-lla    pneumoniae）产生的异淀粉酶（普鲁兰酶）和1，4葡聚糖磷酸化酶，以及由大肠杆菌产生的三种氨基酰tRNA合成酶，并获得专利权〔西德专利DE2616584（1977）〕，采用葡聚糖、聚乙二醇、水两相系统，虽可对细胞、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等生物大分子或颗粒进行分离纯化，但由于葡聚糖的价格十分昂贵，不利于大规模工业生产上使用。

本发明的任务是给酶制剂大规模生产过程提供一种成本低廉、操作简单、效率高而且安全的分离纯化技术，使经过纯化的产品可供食品加工业及其它方面应用。

本发明采用了价格低廉的、对人畜安全的高聚物、盐、水构成的两相系统，对酶制剂进行分离提纯。具体做法是：用聚乙二醇（简称PEG）、盐、水构成的两相系统，通过液、液萃取操作方法（见具体操作方法），纯化发酵生产的枯草杆菌α-淀粉酶，以及其它酶制剂（包括蛋白酶、脂肪酶等发酵生产的酶制剂），使之能适用于食品加工工业。

枯草杆菌α-淀粉酶是工业发酵液喷干粉，它内部含有大量杂质（包括培养基附随物、细菌菌体、色素等），并带有不愉快的气味。利用α-淀粉酶、杂质在水两相系统中有不同的分配行为，可以将它们分离。首先令粗酶混悬液于〔10～30%（最好是20.5%）PEG/10～20%（最好是13.7%）（NH₄）₂SO₄〕两相系统中进行分相，分相后，90%以上的α-淀粉酶存在于上层相（PEG相）中;不溶性物质（如菌体、培养基附随物）聚集于两相界面;亲水性色素则分布于下层相（硫酸铵相）。去除下层相后，加入适量磷酸盐（Na₂HPO₄-NaH₂PO₄）缓冲液，构成10～30%（最好是13.7%）PEG/10～30%（最好是10%）磷酸盐两相系统，此时α-淀粉酶转入新的下层相里（即磷酸盐相），而其它杂质、色素则存留于上层PEG相中。去除上层相后，就可以获α-淀粉酶溶于磷酸缓冲液中的液态制剂。这种液态α-淀粉酶制剂无色、无味。经透析除盐、冻干，便可制成粉状制剂，可用于食品加工业，或供进一步精制的中间原料。

提纯α-淀粉酶所用试剂有下列几种：

1.50%（每一百克溶液含PEG50克。以下均同）聚乙二醇（PEG6000）胶态溶液。

2.50%（每一百毫升溶液含硫酸铵50克。以下均同）硫酸铵（NH₄）₂SO₄溶液。

3.25%（每一百毫升溶液含磷酸盐25克，以下同）磷酸盐〔Na₂HPO₄-NaH₂PO₄〕缓冲液，PH值为6.0。

4.12.5%（每一百毫升溶液中含酶制品12.5克）枯草杆菌α-淀粉酶粗酶混悬液。

具体操作方法如下：

1.取容积为125毫升带刻度的液漏斗，称重加入50%PEG溶液10～30克（最好是20.5克），终浓度为10～30%（最佳为20.5%），用移液管加入50%（NH₄）₂SO₄溶液10～20毫升（最好是13.7毫升），终浓度为10～20%，（最好为13.7%），12.5%粗酶液16.0毫升。系统总体积为50毫升（以上重量、体积均可按比例放大或缩小）。充分摇荡均匀，静置待分层清晰后，记录上下相体积，各取出1毫升，进行酶活力及蛋白质浓度测定。

2.从分液漏斗放出下层相。上层相仍留在分液漏斗中，再加入25%磷酸盐缓冲液35毫升，蒸馏水25毫升（以上重量、体积均可按比例放大，缩小）。充分摇匀，静置分层记录两相体积。各取出1毫升，按Bernfeld法测α-淀粉酶活力及蛋白质浓度。在581-G型比色计中使用绿色滤光片追踪黄色色素的分布动向。

3.分出下层相得α-淀粉酶精制品浓液中透析除盐，冻干即得成品。

在本项发明“高聚物、盐、水”两相系统中，所用高聚物聚乙二醇完全无毒，对人畜安全，是合格的食品填充剂。由于构成两相系统的主要成份是水，因而有利于酶蛋白的稳定性;使用本系统所需设备简单，操作方便，分离迅速，效率高，操作规模可以根据生产情况准确放大和缩小。且原材料成本低廉，适宜于大规模工业生产过程的使用。