[发明专利]一种耐冷好氧反硝化简单芽孢杆菌原生质体制备与转化的方法

说明书

本发明公开了一种耐冷好氧反硝化简单芽孢杆菌原生质体制备与转化的方法。本发明所述制备与转化方法为：首先进行培养液的制备，然后进行原生质体悬液的制备，随后将原生质体悬液涂布于高渗固体培养基上进行原生质体的再生，以评估原生质体细胞的质量，最后PEG介导质粒转化原生质体。所获得的原生质体制备率可达95.94％，再生率可达16.35％，对质粒pNZTT和pMA5的转化分别可达到5.8和4.6个转化子/μg DNA。本发明原生质体制备与转化方法操作简单，可重复性强，不需要特定的转化设备，可为该野生菌株后续进行基因操作和分子水平改良提供基础。

技术领域

本发明涉及水处理微生物技术领域，具体涉及一种耐冷好氧反硝化简单芽孢杆菌原生质体制备与转化的方法。

背景技术

近年来，随着农业氮肥的施用、垃圾填埋的渗滤、工业废水和生活废水等的排放，过量的氮素被排放到环境中，导致水体富营养化藻类大量繁殖，进而使得水质恶化，对水生生物造成危害，同时也严重影响人体健康，因此水体中氮素污染物的去除成为环境治理所需迫切解决的问题。

好氧反硝化微生物可在有氧条件下将氮素污染物(如硝酸盐氮以及亚硝酸盐氮)逐步还原生成无污染的氮气排放到环境中。该种脱氮方式提高了氮素去除效率，缩短处理时间，使得硝化反应和反硝化反应能够在同一反应器中进行，同时节约了操作成本并且具有绿色环保无污染的特点。目前发现的好氧反硝化微生物大部分为常温菌，脱氮工作温度通常在25～37℃。在冬季或是低温地区，由于水温偏低，这类中温菌的生长和代谢速率会受到严重抑制，难以达到含氮污水生物处理的要求。

现有的研究表明将在低温条件下生长并具有良好活性的耐冷好氧反硝化菌应用于处理低温含氮废水是一种有效的解决措施。为了从分子水平解析耐冷好氧反硝化菌的反硝化代谢通路同时通过分子改良提高该菌的脱氮效率，有必要构建一种适合于该耐冷好氧反硝化菌的遗传转化方法。

研究表明在一些芽孢杆菌中存在着特殊的限制性修饰系统使得菌株无法进行转化或是转化率较低。由于不同菌株生理特性的不同，其中一些菌株的原生质体再生率很低或是无法再生，有的菌株在形成原生质体后甚至会发生自溶现象。原生质体制备与转化效率除了与菌株自身的生理特性相关，还会受到诸多因素如溶菌酶浓度、酶解温度和酶解时间等的影响，使得不同菌株之间的原生质体制备再生与转化效率各异。

芽孢杆菌主要的遗传转化方法有：化学转化法、电击转化法以及原生质体转化法，这些转化方法主要针对于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌等，而关于简单芽孢杆菌遗传转化的方法国内外鲜有报道。同时在前期的实验中发现化学转化法和电击转化法均无法对野生型耐冷反硝化简单芽孢杆菌进行有效转化。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种耐冷好氧反硝化简单芽孢杆菌原生质体制备与转化的方法。本发明通过优化原生质体制备和再生过程中的酶解条件以及优化原生质体转化后的恢复条件，提高了原生质体形成率、再生率和转化率。本申请原生质体制备与转化方法操作简单，可重复性强，不需要特定的转化设备，可为该野生菌株后续进行基因操作和分子水平改良提供基础。

本发明的技术方案如下：

一种耐冷好氧反硝化简单芽孢杆菌原生质体制备与转化的方法，所述方法如下：

(1)培养液制备：

将简单芽孢杆菌活化后，挑选单菌落接入LB培养基中振荡培养后得到种子液，将种子液接种于PAB培养基中培养，得到培养液；

(2)原生质体悬液的制备：

将步骤(1)的培养液离心，收集菌体，使用原生质体稳定液洗涤后重悬于原生质体稳定液中得到菌悬液，并加入溶菌酶得到含酶菌液，进行酶解，降温，再次离心，沉淀用原生质体稳定液洗涤后，重悬于原生质体稳定液中，即得菌株的原生质体悬液；

(3)原生质体的再生：