[发明专利]一种耐冷好氧反硝化简单芽孢杆菌原生质体制备与转化的方法

权利要求书

1.一种耐冷好氧反硝化简单芽孢杆菌原生质体制备与转化的方法，其特征在于，所述方法如下：

(1)培养液制备：

将简单芽孢杆菌活化后，挑选单菌落接入LB培养基中振荡培养后得到种子液，将种子液接种于PAB培养基中培养，得到培养液；

(2)原生质体悬液的制备：

将步骤(1)的培养液离心，收集菌体，使用原生质体稳定液洗涤后重悬于原生质体稳定液中得到菌悬液，并加入溶菌酶得到含酶菌液，进行酶解，降温，再次离心，沉淀用原生质体稳定液洗涤后，重悬于原生质体稳定液中，即得菌株的原生质体悬液；

(3)原生质体的再生：

将步骤(2)得到的原生质体悬液用原生质体稳定液稀释后，涂布于固体培养基上，培养，得到原生质体再生菌落；

(4)原生质体的转化：

在步骤(3)所述的原生质体悬液中加入质粒与2x原生质体稳定液的混合液，得到含质粒的原生质体溶液，加入聚乙二醇溶液混合，再用原生质体稳定液稀释得到稀释液，离心，沉淀用原生质体稳定液洗涤后，重悬于原生质体恢复培养基中，培养6～18h后，涂布于DM3再生培养基中培养，得到原生质体转化子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述简单芽孢杆菌保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021934，保藏名称为简单芽孢杆菌(Bacillussimplex)H-b。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述活化的方法为：将简单芽孢杆菌在LB平板上划线后，于25～37℃下培养12～24h；所述振荡培养的条件为：挑取单菌落接入10～20mL LB液体培养基中，在25～37℃，150～250rpm条件下振荡培养12～18h；所述种子液的培养条件为：将种子液按0.5～1.5％体积分数的接种量接种于PAB培养基中，在25～37℃，150～250rpm下培养6～12h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述LB培养基与PAB培养基pH值均为7.0～7.2，使用前均需在115～121℃下灭菌15～25min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养液离心的速度为6000～10000rpm，时间为5～10min；所述菌悬液中菌浓度为0.9×10⁸～1.1×10⁸个/mL；所述溶菌酶的活性≥20000U/mg，溶菌酶的浓度为10mg/mL，所述含酶菌液中溶菌酶的终浓度为0.1～0.2mg/mL；所述酶解的温度为20～30℃，时间为20～30min；优选地，所述含酶菌液中溶菌酶的终浓度为0.1mg/mL，所述酶解的优选温度为25℃，时间为25min；所述降温是将含酶菌液酶解结束后置于冰水浴中降至0℃；所述再次离心的速度为3000～4000rpm，时间为8～15min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述原生质体稳定液中顺丁烯二酸的终浓度为0.02mol/L，MgCl₂·6H₂O的终浓度为0.02mol/L，蔗糖的终浓度为0.5mol/L，pH值为5.5～7.5。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述固体培养基为固体DM3再生培养基，pH值为7.0～7.2；所述培养的条件为在30～37℃恒温培养箱中培养1～2天；所述稀释是原生质体悬液用原生质体稳定液稀释10⁵～10⁷倍。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述原生质体悬液与混合液的体积比为2～12：1；所述混合液中，质粒与2×原生质体稳定液的体积比为1：1；所述聚乙二醇溶液与含质粒的原生质体溶液的体积比为40：9～32；所述聚乙二醇溶液包括聚乙二醇6000和2×原生质体稳定液，其中聚乙二醇6000的质量体积分数为35～45％；所述稀释的倍数为2～7；所述离心的速度为3000～3500rpm，时间为8～15min。