[发明专利]一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法

权利要求书

1.一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、取新鲜的消化道肿瘤组织，使用PBS清洗后，切碎；

步骤二、向组织碎片中加入组织消化液消化，短时多次消化，收集上悬液与细胞/组织沉淀；

步骤三、离心收集消化后的细胞/组织沉淀；

步骤四、将组织细胞接种至预制的基质胶顶部使用对应的类器官培养基进行培养；

步骤五、一段时间后转至胶滴中包埋培养。

2.根据权利要求1所述的一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法，其特征在于，步骤一所述消化道肿瘤包括胃癌、胰腺癌、结直肠癌中的任意一种；

步骤一所述PBS清洗是将获取的肿瘤组织放入离心管中，加入10倍体积的PBS摇晃清洗，并弃去上清；

步骤一所述的切碎是将肿瘤组织置于细胞培养皿上用手术刀切碎至0.5mm³的小块。

3.根据权利要求1所述的一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法，其特征在于，步骤二所述消化是将肿瘤组织碎片置于离心管中，加入至少5倍体积的组织消化液，在恒温摇床中，37℃，200RPM消化处理；

步骤二所述短时多次消化是指每次将消化时间控制在3-5分钟，通过自然沉降收集上悬液并加入大比例PBS置冰上终止，补齐消化体系，重复上述步骤，直至组织大部分消化，仅剩少量的组织碎片。

4.根据权利要求1所述的一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法，其特征在于，步骤三所述的离心收集是将步骤二收集到的上悬液与剩余沉淀一同在4℃、250g条件下离心5分钟，去除上清，获得细胞/组织沉淀。

5.根据权利要求1所述的一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法，其特征在于，步骤四所述预制的基质胶是将基质胶与DMEM按体积比2:1混合，添加至6孔板中，37℃孵育使凝固，形成一层1mm的凝胶层；

步骤四所述的细胞接种是将步骤三收集到的细胞/组织沉淀用对应的含10%基质胶的类器官培养基重悬后，加入预制的基质胶顶部，使其自然分散；

步骤四所述的对应的类器官培养基是指胃癌组织使用胃癌类器官培养基，胰腺癌组织使用胰腺癌类器官培养基，结直肠癌组织使用结直肠类器官培养基；

步骤四所述的培养是指在37℃、二氧化碳含量5%的环境中进行培养。

6.根据权利要求1所述的一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法，其特征在于，步骤五所述的一段时间是指3-5天，在六孔板预制的基质胶中培养3-5天，过程中每2-3天进行一次换液；

步骤五所述的转至胶滴中包埋是指吸去步骤四的培养上清，每孔加入3mL DISPASEII，用巴斯德滴管将胶滴吹散，于37℃条件下孵育15-20分钟，收集悬液，使用1mL吸头吹打10-20次；4℃、250g条件下离心5分钟，去上清，向细胞沉淀中加入稀释的基质胶混匀，对应的类器官培养基与基质胶的体积比为1:2；按照每滴25-40μL的体积接种至细胞培养板中，37℃待胶滴凝固；

步骤五所述的培养是指加入对应的类器官培养基，在37℃、二氧化碳含量5%的环境中进行培养。

7.根据权利要求1所述的一种高效的消化道肿瘤类器官培养方法，其特征在于，所述步骤二中的组织消化液包括以下浓度的组分：200-500μg/mL Collagenase II、10-20μg/mLDNAseⅠ、10-15nmol/mL Y-27632、1× GlutaMAX和1× penicillin/streptomycin的advance DMEM/F12培养基。