[发明专利]一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法

权利要求书

1.一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①配置液体培养基: 在MS液体培养基中加入抗生素母液，抗生素母液的工作浓度为50μg/ml；-20℃保存备用；

②带菌枝条消毒：选取需要脱除病菌的柑橘成年树枝条，制成外植体，消毒15-25分钟，无菌水冲洗4-5次，获得灭菌枝条；

③在灭菌试管中装入2ml 步骤①配制的液体培养基，将步骤②获得的灭菌枝条放置于灭菌试管中，在光照强度为1600-2200Lux，温度为25℃，16小时光照与8小时黑暗的循环模式条件下培养，10-15天后陆续长出新芽；

④配制诱变液体培养基：将MT液体培养基与EMS液体培养基混合，配制成诱变液体培养基；

⑤茎段长出新芽后，取新芽剥掉芽外部叶片，对长出新芽的枝条进行剥取，获得长度为0.4-0.6mm的茎尖生长点；将茎尖生长点接种于2-3ml诱变液体培养基中，室温放置，获得诱变茎尖生长点；

⑥选取枳壳或枳橙种子，剥去外种皮，消毒，用无菌水清洗，获得消毒砧木种子；

⑦将消毒砧木种子接种到MS固体培养基中，25℃暗培养13～15天，获得高度为6～9cm的黄化小苗；

⑧选取茎直径≥2mm的黄化小苗，切去茎上部，在离茎上端 3～5mm处切出T形切口；将诱变茎尖生长点置于T形切口的中间，获得嫁接苗；

⑨将嫁接苗置于培养箱中，在光照强度为1600-2200Lux，温度为25℃，16小时光照与8小时黑暗的循环模式条件下进行嫁接培养，至待接穗芽长至0.5～1cm 时，再二次嫁接于温室。

2.根据权利要求1所述的一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，其特征在于：所述抗生素母液是抽滤处理过的。

3.根据权利要求1或2所述的一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，其特征在于：所述抗生素为硫酸链霉素。

4.根据权利要求1所述的一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，其特征在于：所述灭菌试管在使用前用封口膜封好，灭菌后备用。

5.根据权利要求1所述的一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，其特征在于：所述EMS液体培养基的体积百分浓度为0.1%。

6.根据权利要求1所述的一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，其特征在于：所述MT液体培养基与EMS液体培养基的体积比为100：（0.08—0.12）。

7.根据权利要求6所述的一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，其特征在于：所述MT液体培养基与EMS液体培养基的体积比为100：0.1。

8.根据权利要求1所述的一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，其特征在于：所述MT液体培养基中蔗糖的质量浓度为7～8%。

9.根据权利要求1所述的一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，其特征在于：所述步骤⑤将茎尖生长点接种于诱变液体培养基中，用封口膜封好，室温放置3-5个小时。

10.根据权利要求1所述的一种无菌条件下化学诱导柑橘芽变的方法，其特征在于：所述外植体的制备方法，包括以下步骤：

选取外观无明显病斑，长势较好的需要脱除病菌柑橘成年树枝条，剪去叶片，清洗表面尘土，切成6～7cm长的茎段。