[发明专利]一种抗虫蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种新抗虫蛋白的制备方法及其应用，属于基因工程领域。本发明提供了一种新抗虫蛋白及其编码基因，新蛋白为抗虫突变蛋白，该抗虫突变蛋白为Cry1Ie4蛋白在第174位、第209位和第260位发生了突变的蛋白。所述应用是编码基因在培育抗虫转基因玉米植株中的应用，在制备抗虫突变蛋白中的应用，以及抗虫突变蛋白在制备杀虫剂中的应用。本发明通过对Cry1Ie4蛋白的人工改造，提高了它的活性。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗虫蛋白及其制备方法和应用，具体为改造的Cry1Ie4蛋白。

背景技术

目前，商业化的转基因抗虫玉米中，含有Cry1Ab蛋白（例如MON810、DBN9936）的玉米具有很好的玉米螟控制效果。然而，随着转基因抗虫玉米产业化种植规模逐步扩大，国外已有报道玉米螟对Cry1Ab玉米产生了抗性，而我国的转基因玉米商业化的政策也在逐步开放。为了提前做好玉米螟的抗性管理，开发不具Cry1A类交互抗性的抗虫玉米是有效的管理手段之一。已有研究表明，Cry1I类与Cry1Ab没有交互抗性，替换或者与该蛋白进行叠加，可以延缓玉米螟抗药性的产生（Xu L, Wang Z, Zhang J, et al. Cross-resistance ofCry1Ab-selected Asian corn borer to other Cry toxins[J]. Journal of AppliedEntomology, 2010, 134(5): 429-438.）。

在已经鉴定到的Cry类Bt抗虫基因（苏云金芽胞杆菌 Bacillus thuringiensis基因，简称Bt基因）中，Cry1I类蛋白具有独特性，它们具有类似于Cry和VIP两者的生物化学特性，其在苏云金芽孢杆菌菌株中通常是沉默基因，在大肠杆菌培养中可以以大约81 kDa的原毒素形式表达，这是Cry1类蛋白中独一无二的分子质量。此外，Cry1I类蛋白的靶标昆虫种类包括鳞翅目和鞘翅目，且与Cry1A类蛋白不会产生交互抗性。因此，Cry1I类基因的研究具有更为重要的理论意义和实用价值，并将为解决 Bt 毒素杀虫谱较窄、害虫抗药性产生等问题提供新的基因选择。

据报道称，Cry1Ie4对小菜蛾和玉米螟具有杀虫活性（K·S·桑普森，D·J·汤姆索，R·V·杜米特鲁.杀虫蛋白和使用它们的方法：CN201080018183.X[P].CN102421905B），但经过实验室测试发现Cry1Ie4对玉米螟的杀虫活性远低于Cry1Ab，因此利用Cry1Ie4开发转基因玉米难以达到商业化种植的要求。本项目为了获得与Cry1Ab没有交互抗性的新蛋白，通过对杀虫蛋白Cry1Ie4毒性区的改造从而增强其杀虫活性，并投入抗虫玉米开发，将具有很好的应用前景。

发明内容

为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，通过对Cry1Ie4蛋白的进行点突变，提高了其杀虫活性，拓展了其应用范围。

发明人发现Cry1Ie4对玉米螟的活性并不显著，而对杀虫蛋白毒性区的改造能够增强蛋白的杀虫活性。因此，本发明通过改造Cry1Ie4蛋白获得更佳的玉米螟杀虫活性并应用于抗虫玉米的开发，其具有很好的应用前景。

首先，发明人通过连续易错PCR方法对编码Cry1Ie1蛋白的核酸分子进行突变，并将突变子表达蛋白，然后通过玉米螟生测试验筛选出了有更高杀虫活性的突变蛋白，分析编码蛋白的核苷酸序列，找到了突变位点。因为同属于Cry1Ie类蛋白，在上述研究的基础上，本发明在Cry1Ie4中找到同源的活性位点并进行突变，然后通过玉米螟生测筛选出了优于Cry1Ie4的6种重组蛋白。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种抗虫突变蛋白，其为改造的Cry1Ie4蛋白；其中，所述改造的Cry1Ie4蛋白含有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列且在以下位点中进行突变：第174位、第209位和第260位。