[发明专利]一种原代组织冻存液及其冻存、复苏和消化方法

说明书

本发明公开了一种组织冻存液，包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 60~80份，胎牛血清10~20份，二甲基亚砜10~20份，ROCK抑制剂0.05~0.15份。本发明的组织冻存液，适用性广，可以用于人体和动物组织的冻存。适用的组织类型包括：实体瘤组织、肺、肝脏、消化道、睾丸、胰腺、神经组织，以及神经胶质瘤类器官组织等。冻存于液氮或者‑80℃的组织，经过复苏和组织消化后活力可以达到75%以上，经过消化获得的原代细胞，可以按照常规的方法进行类器官培养和其他生物学测试。

技术领域

本发明属于组织类器官培养技术领域，具体涉及一种原代组织冻存液及其冻存、复苏和消化方法。

背景技术

在围绕神经系统的研究中，神经元的原代分离培养是非常重要的体外研究，用于研究神经细胞的各种生理功能，由于神经组织获得的局限性，关于神经元原代分离主要是在啮齿类哺乳动物上进行。例如，常用于神经元原代分离的啮齿类动物有胎鼠、新生鼠。然而由于神经元细胞缺乏增殖能力，一次原代分离后，在体外不适宜长期存活、生长、分化，不利于研究的顺利进行；此外，对于原代神经元来说，其对外界环境尤为敏感，不良刺激后极易死亡，所以神经组织的原代细胞体外实验中，一般都是现用现分离新鲜组织培养，这就导致了在研究原代神经元时，由于研究目标取材的限制，例如胎鼠、新生鼠获取的不易、周期较长，综合导致研究周期成本的增高。

细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已深入广泛的应用。研究人员经常需要冷冻细胞并保存，以供后续实验或临床使用。传统的低温冷冻保存技术是将二甲亚砜和血清中加入细胞混悬液后放入冻存管中，于-80℃冰箱慢慢冷冻后，将冻存管置于液氮中保存，使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，需要时快速解冻。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄增、交换和运输某些细胞。细胞冻存时加入保护剂终浓度5％-15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用慢冻快融的方法能较好地保证细胞存活。

 组织类器官(Tissue Organoids)是从机体（人体和动物）组织干细胞衍生而来的组织类似物。来自于特定疾病类型的患者组织（最常见的是肿瘤组织），经过在实验室培养，形成可以保留来源组织的病理组织结构特征、遗传特征和细胞类型异质性的类器官。类器官具有可以在体外长期培养、传代、冻存和复苏的特征，因此，类器官为基础科研和临床转化医学提供了一种非常灵活的工具，在疾病研究、再生医学、新药研发和临床精准医疗中具有重要意义。

制备类器官的第一步是组织取样，组织的初始样本量和新鲜程度直接决定了类器官培养的成功率。但是在实际情况中，常常出现组织取材后不能第一时间进行类器官培养，或者需要进行长距离运输超过48小时的情况，这样组织中细胞活力的保持就是最大的难题。目前，市场上还没有一款产品是用来进行组织冻存的试剂，采用已有的细胞冻存的方法进行组织冻存，导致组织复苏后细胞活力显著降低，基本不能用于类器官的培养。

发明内容

本发明针对已有的细胞冻存的方法进行组织冻存，导致组织复苏后细胞活力显著降低，基本不能用于类器官的培养的问题，提供一种原代组织冻存液及其冻存、复苏和消化方法，消化后的细胞可以进行常规的类器官培养，真正解决了长距离运输组织和长时间冻存组织类器官培养成功率低的难题。

 本发明提供的一种组织冻存液，包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F1260~80份，胎牛血清（FBS）10~20份，二甲基亚砜10~20份，ROCK抑制剂（Y27632） 0.05~15份 。

 优选的所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 60份，胎牛血清20份，二甲基亚砜20份，ROCK抑制剂0.1份。