[发明专利]一种原代组织冻存液及其冻存、复苏和消化方法

权利要求书

1.一种组织冻存液，其特征在于，所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：AdvancedDMEM/F12 60~80份，胎牛血清10~20份，二甲基亚砜10~20份，ROCK抑制剂0.05~0.15份。

2.根据权利要求1所述的组织冻存液，其特征在于，所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 60份，胎牛血清20份，二甲基亚砜20份，ROCK抑制剂0.1份。

3.根据权利要求1所述的组织冻存液，其特征在于，所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 70份，胎牛血清20份，二甲基亚砜10份，ROCK抑制剂0.1份。

4.根据权利要求1所述的组织冻存液，其特征在于，所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 70份，胎牛血清10份，二甲基亚砜20份，ROCK抑制剂0.1份。

5.根据权利要求1所述的组织冻存液，其特征在于，所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 80份，胎牛血清15份，二甲基亚砜15份，ROCK抑制剂0.15份。

6.一种原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，其特征在于，所述冻存、复苏和消化方法包括以下步骤：

原代组织收集和冻存：取离体哺乳动物的组织，放置于样本管中，低温保存或冷链运输，转移至培养皿中，滴加权利要求1至5任一组织冻存液保证组织表面润湿，将组织切成碎片，转移至含有权利要求1至5任一组织冻存液的冻存管中，并在液氮温度下长期保存；

组织复苏：将需要复苏的冻存管从液氮中取出，迅速放入恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶时，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有基础培养基的离心管中；

组织消化：复苏后的组织，放入无菌培养皿中，用含有双抗的PBS抽吸冲洗，对标本进行机械分离，将大块的组织分离成为碎片或糊糜状，将经过机械分离的组织，使用巴氏吸管全部转移至无菌离心管中，根据组织量，添加组织消化液，用枪头轻轻吹打组织，使其充分分散；将含有该消化液的离心管放置恒温空气浴的摇床上，进行消化，中间每隔段时间取出，镜下观察分离效果，至大部分组织分离消化后停止，用无菌的PBS进行终止消化，将细胞悬液用筛网进行过滤，用无菌PBS清洗筛网，将细胞悬液过滤至新的离心管中，将上述含有细胞滤液的离心管进行离心，小心去除上清，沉淀细胞用PBS清洗一次；向细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，进行后续类器官培养。

7.根据权利要求6所述的原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，其特征在于，在所述原代组织收集和冻存步骤中，采集手术切除或穿刺的新鲜组织，避开坏死、溃疡部位，组织离体后尽快放置于专用样本管中，并置于4℃保存或冷链运输；样本运送至超净细胞间后，在生物安全柜中操作，将组织块转移至10cm培养皿中，滴加少量权利要求1至3任一组织冻存液保证组织表面润湿，采用无菌手术刀和刀片，对组织进行机械分离，直至成为大约1×1×1mm³的细小碎片，使用巴氏吸管将组织碎片转移至含有2ml组织冻存液的冻存管中，室温平衡1小时，使用-1℃/分钟慢速控制冷却方案或异丙醇冷冻容器冷冻保存组织，并在液氮温度-196°C下长期保存，也可放入程序性冻存盒内于-80℃冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。

8.根据权利要求6所述的原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，其特征在于，在所述组织复苏步骤中，将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中。