[发明专利]一种识别犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体、检测试剂及应用

说明书

本发明公开了一种识别犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体、检测试剂及应用，所述单克隆抗体含有名称为Vsubgt;H/subgt;的重链可变区和名称为Vsubgt;L/subgt;的轻链可变区，所述Vsubgt;H/subgt;和Vsubgt;L/subgt;均由互补决定区和框架区组成。试验证明，本发明提供的单克隆抗体在制备用于检测犬瘟热病毒夹心ELISA抗原检测试剂盒和犬瘟热病毒胶体金检测试纸条中，对犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒均无明显交叉反应，具有良好的特异性和更高的灵敏度，与病毒分离鉴定经典方法符合率高。

技术领域

本发明涉及动物疫病快速生物检测技术领域，具体涉及一种识别犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体、检测试剂及应用。

背景技术

犬瘟热（caninedistemper，CD）是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒（caninedistemper virus，CDV）引起的一类高度接触性、致死性传染病，常导致全身性包括呼吸系统、胃肠道、中枢神经系统等疾病，且容易继发其他细菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率高达80%。近几年，随着宠物犬养殖数量的增多，犬瘟热的发病率也在增加。

犬瘟热病毒颗粒的形状是不规则的圆形，在室温条件下病毒不稳定。犬瘟热病毒对紫外线的照射、干燥的空气和高温环境都很敏感，但在2~8℃可保存较长时间。犬瘟热病毒的抵抗力十分差，常规消毒方法如有机溶剂、紫外线照射、乙醚、来苏儿、甲醛等常规消毒剂可以快速灭活犬瘟热病毒，pH值4.5以下或pH值9.0以上的强酸或强碱性环境中均可以快速使其失活。

犬瘟热病毒是有囊膜的单股负链RNA病毒，其基因组全长约为15kb，包括38个核苷酸构成的5’端前导序列和55个核苷酸构成的3’端前导序列，前导序列具有启动调节序列、指导基因转录过程的功能，还能够调控犬瘟热病毒基因转录终止、重启的过程。犬瘟热病毒的整个基因组包括有6个非重叠编码区，6个开放阅读框分别编码6种结构蛋白，从3’到5’端依次为核衣壳蛋白（N）、膜蛋白（M）、磷蛋白（P）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）、大蛋白（L）。其中N蛋白是犬瘟热病毒的蛋白中含量最高的，N蛋白有包裹及保护内部基因的功能，在犬瘟热病毒感染的早期免疫应答中起着重要作用，与细胞核定位和病毒复制及其相关。不仅如此，N蛋白是保守性较强的免疫原性蛋白。

研究表明，N蛋白分子量约为58kDa，N蛋白共有1683个氨基酸，根据其保守性，N蛋白一共可以划分为三个区，第一个区是N末端（17aa-159aa）的一段可变序列，接着是一段高度保守的序列（160aa-407aa）和C端的一段可变区（408aa-519aa）。高度保守性的N蛋白含量最高，主要由NP蛋白构成，是麻疹病毒属的主要交叉抗原。犬瘟热病毒的RNA牢牢地缠绕在NP蛋白上，形成螺旋状的核衣壳结构。在犬瘟热病毒感染宿主细胞的过程中，N蛋白能够刺激机体产生强烈的体液免疫反应，在感染的早期就能检测到大量针对N蛋白的抗体，远远早于针对F、H等蛋白产生的中和抗体。

目前犬瘟热病毒病原诊断的方法有病毒分离鉴定、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT-PCR等多种检测手段，犬瘟热病毒抗体诊断的方法有血清中和试验、酶联免疫吸附试验、免疫层析分析等免疫学检测手段。但病毒分离鉴定等经典方法涉及病毒感染，细胞培养等试验过程，对试验人员要求高，操作时间长，可重复性低，更适用于实验室检测，不适用于临床检测中的广泛应用。

通过基因工程表达系统制备高保守性的N蛋白，免疫小鼠利用杂交瘤细胞技术筛选灵敏度高、特异性高的单克隆抗体，获得优质的抗原抗体原料后利用酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析等免疫学技术，为建立特异性强，敏感性高，简便快速的试纸条及ELISA方法，用于犬临床样品中犬瘟热病毒抗原或抗体的批量检测。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种识别犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体、检测试剂及应用，具体包括如下技术方案：