[发明专利]一种皮肤类器官外泌体及其制备方法和应用

说明书

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种皮肤类器官外泌体及其制备方法和应用。本发明方法取全层皮肤组织消化解离出具有干性的细胞后培养为皮肤类器官，再使用物理‑生理联用刺激所述皮肤类器官分泌出外泌体。本发明得到的外泌体在针对自然衰老皮肤修复和紫外诱导的光老化皮肤修复中具有显著的效果。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种皮肤类器官外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

生命的进展过程中，皮肤的物理变化是体现机体老化的首要观察结果。长久以来，人们致力于通过各种抗衰老方法来改善皮肤的质量。通常认为，皮肤的老化是由外在因素(环境方面包括紫外线照射、空气污染、吸烟或营养缺乏)和内在因素(例如细胞老化和荷尔蒙变化)共同决定的，这些因素都会导致皮肤功能和再生潜力的丧失。特别是，内在皮肤老化是一个随年龄增加而不可避免的加剧的过程，其主要因素包括活性氧（ROS）的形成(加速皮肤老化，水分流失)、端粒磨损加速或基质金属蛋白酶(MMP)表达增加(结构完整性丧失，拉伸强度和弹性下降)，这些因素都会导致皮肤形态发生变化。此外，炎症性皮肤疾病和难愈合伤口，也是一直困扰人们的皮肤缺陷问题。

对于上述皮肤衰老或缺陷问题，目前采用的改善策略包括使用化学、生物或物理手段的局部非侵入性和侵入性策略。非侵入性策略主要以化妆品、化学换肤和光疗的方式出现。从功效方面看，以抗氧化剂和细胞调节剂为主的化妆品可用于增强皮肤对ROS引起的氧化应激保护。激光治疗策略能够产生胶原蛋白和弹性蛋白、重塑真皮以及减少色素和红斑等，但并不是每个人的皮肤都适用，相当多的人会产生强烈的副作用。在侵入性策略中，微针疗法用于将药物跳过皮肤屏障直接输送到真皮层中，与非侵入性策略相比，具有更直接的效果，但持续时间较短，而且会一定程度造成皮肤受损，甚至会引起皮肤炎症。此外，2000年初兴起的干细胞疗法也曾广泛应用于皮肤治疗。然而，干细胞治疗的安全性和有效性一直存在争议，一些研究表明干细胞本身并不参与治疗过程且注入缺陷部位的干细胞显示出低细胞活力。因此，目前的主流皮肤抗衰策略或多或少都会存在一些安全性和有效性的问题，并不适用于每一个人。因此，开发个体化的皮肤质量改善策略是未来皮肤护理的一大趋势。

外泌体是细胞分泌的直径30~150nm的双层磷脂囊泡，其携带包括脂质、蛋白质和核酸在内的多种生物分子。外泌体可以由大多数类型的细胞分泌，但不同细胞分泌的外泌体中携带的生物分子成分有所不同，且不同的细胞分泌的外泌体的量也是不同的。最近的研究表明外泌体在改善皮肤缺陷（如老化、特应性皮炎和伤口）和修复屏障敏感中具有一定的功效。与干细胞治疗相比，外泌体治疗不是直接用异体细胞来取代自体细胞从而发挥治疗效果，仅是提高和促进原本细胞的功能的和自我修复能力，主要优势是接受者的排斥风险最小。因此使用外泌体可以避免由于细胞成分引起的生物学上的一些风险以及伦理问题。

目前在皮肤护理领域展开研究的外泌体主要是来自人类多能诱导干细胞（IPSC）、骨髓间充质干细胞（MSC）和人真皮成纤维细胞（HDF），其都是单一细胞类型分泌的外泌体，由于不同细胞分泌的外泌体中携带的生物分子成分有所不同，因此并没有真正实现精准化、个体化皮肤护理。此外，外泌体的浓度和量也会对皮肤护理的效果产生很大的差异。由于皮肤是由多种类细胞组成的高度复杂的器官，因此单一细胞类型产生的外泌体成分相较完整皮肤分泌的具有很大的差异，而人体的真正皮肤组织目前还不能在体外长期培养以分泌外泌体，这会涉及到伦理学方面的问题。

综上所述，有必要提出一种新的外泌体制备策略，用于缓解现有技术中存在的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种皮肤类器官外泌体及其制备方法和应用，具体技术方案如下。

一种皮肤类器官外泌体的制备方法，取全层皮肤组织消化解离出具有干性的细胞后培养为皮肤类器官，再使用物理-生理联用刺激所述皮肤类器官分泌出外泌体，具体步骤包括如下：

步骤1：取全层皮肤组织，将其分离为真皮层和表皮层；