[发明专利]毕赤酵母表达猫重组白蛋白及其纯化方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及毕赤酵母表达猫重组白蛋白及其纯化方法。本发明提供了经密码子优化后的猫白蛋白基因、表达载体、宿主菌及其应用，所述猫白蛋白基因具备如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明提供的宿主菌为包含所述猫白蛋白基因且能够高效表达猫白蛋白的毕赤酵母菌。本发明还提供了采用毕赤酵母经重组表达获得的猫白蛋白及经发酵生产的猫白蛋白的方法。本发明提供的猫白蛋白生产工艺简单、价格低廉、蛋白产率高、回收纯度高达97％以上，适用于工业化大规模生产重组猫白蛋白。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及毕赤酵母表达猫重组白蛋白及其纯化方法。

背景技术

白蛋白都是由584个氨基酸组成的单一多肽，是血清中含量最高、功能较多的一种蛋白质。血浆胶体渗透压维持主要依靠血浆中白蛋白。白蛋白在生物体中发挥着目前已知具有维持胶体渗透压、结合和转运配体(如脂肪酸和荷尔蒙等)、参与内源性或外源性物质代谢、抗氧化和自由基清除等一系列重要的生理生化功能。

白蛋白是血浆中分子量最小的蛋白质，具有亲水性，可以自由通过毛细血管壁，在血液循环与细胞外液之间进行动态交换，维持血液和细胞外液的胶体渗透压的平衡。血液中80％的渗透压是由白蛋白承担的，白蛋白静脉输注后可以在15分钟内将3.5倍体积的水分吸入血液循环。细胞在进行能量代谢时会有异常活跃的自由基生成，大量的自由基会扰乱生命的正常秩序，攻击蛋白使血清抗蛋白酶失活，损伤DNA使遗传发生错误并致癌等。作为自由基消除剂，白蛋白不仅能消除体内自由基还能抑制自由基的产生。HSA的34位含Cys残基，有还原性的游离状态巯基，能够清除血液中的活性物质如活性氧等，是关键且主要的抗氧化物质。Cu²⁺能够促进自由基的产生，HSA的N端通过与Cu²⁺紧密结合从而抑制这些自由基的产生。

目前，研究报道的猫白蛋白主要来源是从血中分离，原料来源限制较大，成本较高。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供毕赤酵母表达猫重组白蛋白及其纯化方法，本发明提供了使用基因工程技术制备的猫重组白蛋白，产量较高，成本较低，前景可观。

本发明提供了编码猫白蛋白的核酸，所述核酸具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明提供了包含所述核酸的表达载体。

在一些具体实施例中，所述表达载体包括pPIC9K载体。

本发明提供了转化所述表达载体的宿主菌。

优选的，所述宿主菌包括毕赤酵母菌，所述毕赤酵母菌包括毕赤酵母X-33和毕赤酵母GS115。

在一些具体实施例中，所述宿主菌为毕赤酵母X-33。

本发明还提供了所述宿主菌的构建方法，取所述的表达载体转化感受态菌株后获得所述宿主菌。

进一步的，所述宿主菌经包含0.25～5mg/mL G418的YPD培养基筛选后获得。

本发明还提供了猫白蛋白的制备方法，包括培养如下①或②所述的宿主菌，诱导所述猫白蛋白的表达：

①、所述的宿主菌；

②、所述制备方法制得的所述宿主菌。

在一些实施例中，所述诱导的条件包括：诱导培养基为BMMY培养基，诱导温度28℃，甲醇添加量为0.5％，诱导时间72h。

实验表明，在上述诱导条件下，采用毕赤酵母X-33诱导表达猫白蛋白效率高，效果好，且菌高于毕赤酵母GS115，从而获得更准确的技术效果。

在另一些实施例中，所述宿主菌的培养采用发酵罐培养，所述发酵罐培养步骤包括一级种子培养、二级种子培养、补料发酵培养和诱导发酵培养，其中：