[发明专利]一种共表达芽孢杆菌来源增强因子提高重组蛋白在枯草芽孢杆菌中表达量的方法

说明书

本发明公开了一种共表达芽孢杆菌来源增强因子提高重组蛋白在枯草芽孢杆菌中表达量的方法，属于酶程技术领域。本发明将编码重组蛋白基因分别与芽孢杆菌来源的PonA、PonA截短体、OppA或SppA共表达，以提高重组蛋白的表达量。结果显示，本发明的方法可使超高温淀粉酶、中温淀粉酶或蔗糖异构酶在摇瓶水平的表达量提高至3.96倍、1.49倍和2.26倍。在3L生物反应器高密度发酵中可将超高温淀粉酶的表达量提高26％。本发明枯草芽孢杆菌作为外源蛋白表达宿主提供了新的可开发靶点，同时为增强因子的优化改造提供了技术支持。

技术领域

本发明涉及一种共表达芽孢杆菌来源增强因子提高重组蛋白在枯草芽孢杆菌中表达量的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌属(Bacillus Cohn)的一种革兰氏阳性菌株。B.subtilis由于不产毒素和致热致敏蛋白，因此被列为美国FDA《GRAS(公认为安全物质)》清单认证菌株，其易于分离培养，可高密度发酵和蛋白分泌能力强的特性，使得枯草芽孢杆菌作为重要的工业菌株，用于生产多种外源重组蛋白和代谢产物，其优秀性状具备较高的鉴定价值。同时，枯草芽孢杆菌具有清晰的遗传背景和成熟的分子生物学基因编辑方法，这有利于对其进行基因改造以强化枯草芽孢杆菌作为重组蛋白生产宿主的表达能力。

进一步提高枯草芽孢杆菌的外源蛋白生产能力是当前研究的重中之重。目前已经采取了许多策略以改造这种模式微生物以获得更高的重组蛋白产量，例如过表达Sec途径相关因子，敲除胞内或胞外蛋白酶，增加伴侣蛋白含量等。然而，这些改造靶点的选取极大程度上依赖于现有的对于枯草芽孢杆菌功能基因注释，而蛋白的合成分泌过程并不是由单一途径参与调控。有研究指出，调控生理相关功能的基因在蛋白质表达或代谢物积累过程中发挥重要作用，如Jennifer Staudacher通过上调翻译起始因子表达水平将异源蛋白表达水平提高至3倍，Xiao-Ran Jiang通过调控细胞形态控制基因，将PHB的产量提高至1.8倍。因此，当前对于蛋白质合成分泌相关途径的注释并不完善，这意味着当前的改造策略是相对片面的，从而限制了枯草芽孢杆菌作为表达宿主的进一步开发。

目前针对蛋白质表达过程中其关键作用的因子的鉴定仍不完善，因此急需在现有基础上，开发其他新型能够增强重组蛋白在枯草芽孢杆菌中表达的因子。

发明内容

为解决现有技术中重组蛋白在枯草芽孢杆菌中表达量有限的问题，本发明提供了一种提高枯草芽孢杆菌中重组蛋白表达量的方法，所述方法是在表达重组蛋白的同时过表达芽孢杆菌A类青霉素结合蛋白PonA、A类青霉素结合蛋白PonA截短体、ABC途径转运蛋白OppA或信号肽肽酶SppA。

在一种实施方式中，所述的PonA是来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的A类青霉素结合蛋白。

在一种实施方式中，来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的PonA蛋白为PonA(Bs)，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO.1具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性的氨基酸序列。

在一种实施方式中，来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的PonA蛋白为PonA(Bl)，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO.2具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一性的氨基酸序列。