[发明专利]一种靶向敲除CsWRKY41基因的sgRNA、CRISPR/Cas9载体及应用

说明书

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种靶向敲除CsWRKY41基因的sgRNA、CRISPR/Cas9载体及方法和应用。本发明提供了CsWRKY41基因在调控柑橘韧皮部结构中的应用。CsWRKY41基因与柑橘韧皮部结构的改变有关，靶向敲除CsWRKY41基因能够增加柑橘韧皮部厚度。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种靶向敲除CsWRKY41基因的sgRNA、CRISPR/Cas9载体及方法和应用。

背景技术

WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子家族，但目前在果树中关于WRKY转录因子功能研究较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向敲除CsWRKY41基因的sgRNA、CRISPR/Cas9载体及方法和应用。CsWRKY41基因与柑橘韧皮部结构的改变有关，靶向敲除CsWRKY41基因能够增加柑橘韧皮部厚度。

本发明提供了CsWRKY41基因在调控柑橘韧皮部结构中的应用。

本发明还提供了靶向敲除或敲减CsWRKY41基因或降低CsWRKY41基因表达的试剂在增加柑橘韧皮部厚度中的应用。

优选的是，所述靶向敲除CsWRKY41基因的试剂包括靶向敲除CsWRKY41基因的CRISPR/Cas9载体；所述载体中含靶向敲除CsWRKY41基因的sgRNA序列。

本发明还提供了一种靶向敲除CsWRKY41基因的sgRNA序列，所述sgRNA序列包括CsWRKY41 sgRNA1和CsWRKY41 sgRNA2；所述CsWRKY41 sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CsWRKY41 sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种靶向敲除CsWRKY41基因的CRISPR/Cas9载体，所述CRISPR/Cas9载体含上述技术方案所述的靶向敲除CsWRKY41基因的sgRNA序列。

本发明还提供了一种基于CRISPR/Cas9介导CsWRKY41定点编辑改变柑橘韧皮部显微结构的方法，包括以下步骤：

利用CRISPR/Cas9编辑方法定点敲除柑橘的CsWRKY41基因，获得韧皮部显微结构改变的柑橘。

优选的是，所述CRISPR/Cas9编辑方法使用的载体包括靶向敲除CsWRKY41基因的CRISPR/Cas9载体；所述载体中含靶向敲除CsWRKY41基因的sgRNA序列；所述sgRNA序列包括CsWRKY41 sgRNA1和CsWRKY41 sgRNA2；所述CsWRKY41 sgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CsWRKY41sgRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的是，所述方法包括以下步骤：

基于所述靶向敲除CsWRKY41基因的sgRNA序列，构建靶向敲除CsWRKY41基因的CRISPR/Cas9载体，利用农杆菌介导法转化柑橘。

优选的是，所述转化包括转化柑橘的上胚轴。

优选的是，所述柑橘包括哈姆林甜橙。

本发明提供了CsWRKY41基因在调控柑橘韧皮部结构中的应用。靶向敲除敲减CsWRKY41基因或降低CsWRKY41基因的表达能够增加柑橘韧皮部厚度。试验结果表明，本发明通过构建CsWRKY41-sgRNA指导的CRISPR/Cas9编辑载体，利用农杆菌介导法转化哈姆林甜橙上胚轴，使CsWRKY41蛋白功能丧失，实现了CsWRKY41基因在柑橘基因组中的成功编辑，获得CsWRKY41突变体转基因植株，转基因材料叶脉横切面分析显示韧皮部显著增厚。本发明提供方法具有sgRNA靶向性好、对CsWRKY41基因切割效率高、且能在甜橙中获得纯合编辑的植株。

附图说明