[发明专利]褐飞虱靶标融合基因NlCHS-Cht1及其具有高效致死作用的纳米共递送体系

说明书

本发明公开了一种褐飞虱靶标融合基因NlCHS‑Cht1及其具有高效致死作用的纳米共递送体系；其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述纳米化杀虫剂包括1份的六水合硝酸锌、13～14份的2‑甲基咪唑、0.03～0.08份的噻嗪酮和0.05～0.2份的权利要求5所述方法制备得到的dsNlCHS‑Cht1。本发明纳米共递送体系既可通过RNAi与噻嗪酮联用提高杀虫效果，又可通过干扰靶标基因提高褐飞虱对噻嗪酮的敏感性，这为噻嗪酮的抗性治理提供了新的思路和视角，有助于噻嗪酮在害虫防治中的应用，同时提高了RNAi技术在褐飞虱防治中的应用效果，明确了RNAi与化学农药联用的应用潜能。

技术领域

本发明涉及害虫防治领域，具体涉及一种褐飞虱靶标融合基因NlCHS-Cht1及其具有高效致死作用的纳米共递送体系。

背景技术

水稻是我国的第一大粮食作物，每年因病虫草为害造成的损失巨大，褐飞虱是水稻生产上危害最严重的害虫之一。褐飞虱具有远距离迁飞习性，为害发生范围广，爆发频率高，造成的经济损失十分严重。长期以来，防治褐飞虱的主要方法为化学防治。但是由于长期不科学合理使用化学杀虫剂，加速了褐飞虱抗药性进化，导致其对包括噻嗪酮在内的33种杀虫剂产生了不同程度的抗药性。褐飞虱抗药性的产生，降低了多种已有化学杀虫剂的防治效果，然而加大药剂使用量会引起环境污染、农产品质量安全等一系列问题，并且新型化学杀虫剂的研发成本十分巨大，研发所需时间较长，因此，亟需开发新型高效的褐飞虱防治方法。

利用RNAi技术抑制害虫生长发育中的关键基因是有害生物防治近年研究的热点。RNAi介导的基因沉默具有特异性强、沉默效率高等优点，利用RNAi技术抑制害虫生长发育中的关键基因，可阻碍害虫的正常生长发育，甚至导致其死亡，因此RNAi技术在害虫防治领域具有巨大的应用潜力。以RNAi为核心的害虫防治主要可以通过转基因策略和非转基因策略实现，而转基因生物监管准则还不清晰，其安全性也仍然具有很大争议，其发展存在限制。非转基因策略即利用外源dsRNA防治害虫，目前在实际使用过程中存在许多问题限制RNAi的效率。首先，不同昆虫中同一靶标基因的致死效果不同，这给RNAi靶基因筛选增加了难度；其次，dsRNA在递送过程中不稳定，容易发生降解导致RNAi效率较差，并且递送剂量较少难以引起致死效果。在使用RNAi技术进行害虫防治时，针对害虫体内的靶标基因的选择以及RNAi效率的提高等方面还有诸多问题待解决。

纳米材料是指尺寸在1-100nm之间的粒子，其具有尺寸小、比表面积大、易于修饰等特点，在医学中被广泛用于药物分子和生物大分子的递送。近年来，为了提高dsRNA的稳定性以及细胞的摄取效率，纳米材料也逐渐被用于昆虫dsRNA的递送。已有许多研究证明使用纳米材料包裹和递送dsRNA可提高其干扰效率。但在实际应用中不只需要考虑载体的递送性能，还需要考虑环境风险经济效益等因素。如合成脂质体的磷脂等原料价格昂贵，阳离子聚合物不易降解显示出较大的细胞毒性，纳米胶束在跨膜吸收方面仍存在问题等等，还需要进一步选择合适的纳米递送载体。金属有机框架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)材料是一类由金属离子及有机配体自组装而成的多孔材料，具有孔隙率高、比表面积大和结构多样化等独特优点，其多孔结构和多个有机无机作用位点使其容易与各种生物大分子物质(如蛋白质和核酸)结合，是一种潜在的核酸载体。锌离子是一种内源性金属离子，由金属离子Zn²⁺与咪唑或其衍生物组成的金属有机骨架为沸石咪唑骨架(ZIF)，其具有良好的生物相容性。最具代表性的ZIF是ZIF-8，它是由Zn²⁺与二甲基咪唑配位形成的。ZIF-8不仅具有金属有机框架结构合成简单、表面易于修饰、比表面积大、孔径可调、载药能力强等优点，还具有合成原料便宜，生物相容性好，pH响应等特性，有望用于dsRNA递送。