[发明专利]基于亚氨基硼酸酯结构的可电离阳离子类脂及其制备方法

说明书

本发明提供了基于亚氨基硼酸酯结构的可电离类脂及其制备方法与其在治疗小鼠脉络膜新生血管中的应用，具有高效mRNA递送能力；该类脂通过“Ax+By+Cz”一锅法合成，该结构具有微酸和ROS双重敏感性，尤其是类脂lipidoid‑Asubgt;4/subgt;Bsubgt;3/subgt;Csubgt;7/subgt;可以与其他脂质组分以及mRNA分子组装成复合物,且具有最优的mRNA递送效率。除此之外，在小鼠激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）模型中，通过单次玻璃体腔注射，LNP‑Asubgt;4/subgt;Bsubgt;3/subgt;Csubgt;7/subgt;共包载Cas9 mRNA（mCas9）以及靶向VEGFA基因的sgRNA（sgVEGFA）复合物（LNP‑Asubgt;4/subgt;Bsubgt;3/subgt;Csubgt;7/subgt;/mCas9/sgVEGFA复合物）可成功渗透至视网膜RPE层，有效敲除RPE细胞中VEGFA基因且明显减少新生血管的面积。且治疗效果与商业融合蛋白阿柏西普（Aflibercept）相当。该类脂的这些性能使其在生物医用材料尤其是基因递送和基因编辑等领域中具有巨大的开发前景。

技术领域

本发明涉及脂质体制备以及基因负载和递送领域，具体涉及具有高效mRNA递送能力的基于亚氨基硼酸酯结构可电离阳离子类脂的制备方法，并应用于小鼠脉络膜新生血管治疗。

背景技术

湿性老年性黄斑变性（wAMD）是一种眼部新生血管疾病。由于新生血管较正常血管脆弱且不规则，更容易破裂，导致反复渗出、出血。光动力治疗是其主要临床治疗方法，但可能对正常眼部组织造成危害。近年来血管内皮生长因子A(VEGFA)的过表达已被确定为血管生成的主要原因之一，因此，各种VEGFA抑制剂已被批准用于湿性黄斑变性的治疗，例如贝伐单抗、雷珠单抗、苏尼替尼等。然而频繁注射甚至终生注射会造成患者严重的经济负担和毁灭性的眼部并发症。为了达到“一劳永逸”的治疗效果，腺相关病毒(AAV)介导的CRISPR/Cas9基因组编辑系统在wAMD小鼠模型中预防脉络膜新生血管（CNV）取得了成效。但AAV的免疫原性和Cas9长期表达所引起的安全性问题不容忽视。

近年来，基于非病毒的CRISPR/Cas9载体得到发展。脂质体纳米颗粒(Lipidnanoparticles，LNPs)因其转染效率高，细胞毒性低，且免疫原性可忽略不计等优势而成为应用最广泛的非病毒载体。科学家开发了几种用于CRISPR/Cas9递送LNPs用于治疗遗传性疾病和非遗传性疾病。据报道，通过lipofectamine 2000 (LPF 2K) 包载Cas9和sgVEGFA复合物（RNP）后，通过单次视网膜下注射可以敲除RPE细胞中的VEGFA基因，减少CNV面积。然而，这需要高剂量的RNP, 此外LPF 2K的高细胞毒性不可忽视。因此，开发具有侵入性小且具有高基因组编辑效率和低细胞毒性基于的LNP的CRISPR/Cas9传递系统对湿性黄斑变性的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于亚氨基硼酸酯结构的可电离阳离子类脂；以该类脂和辅助脂质组装的脂质体可以有效包载mRNA分子，利用细胞内的高浓度ROS以及溶酶体的微酸性环境触发类脂结构降解，促进核酸分子的胞内释放。此外其具有良好的生物相容性、稳定性。并提供上述基于亚氨基硼酸酯结构可电离阳离子类脂的制备方法和在小鼠脉络膜新生血管治疗中的应用。

本发明提供一种基于亚氨基硼酸酯结构的可电离阳离子类脂，通过“Ax + By +Cz”一锅法合成，随后与辅助脂质（胆固醇、DOPE、DMG-PEG2000）以及mRNA分子通过静电自组装的方式形成脂质体/mRNA复合物。本发明的可电离类脂具有ROS和酸双重响应性，其分子中具有亚胺键以及硼酸酯结构。

本发明采用如下技术方案：

一种基于亚氨基硼酸酯结构的可电离类脂，具有式（I）所示的结构：

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所述式（I）所示的结构中，R₁为具有不同碳原子的烷基链或其他疏水结构，R₂为具有不同结构的含胺分子。