[发明专利]一种原位、动态检测细胞分泌miRNA的方法

说明书

本发明公开了一种原位、动态检测细胞分泌miRNA的方法，属于单细胞分泌物分析技术领域。所述方法为将单细胞和分泌miRNA检测试剂封装在通过涡旋震荡生成的油包水液滴中，所述的分泌miRNA检测试剂为两端分别修饰荧光基团和淬灭基团且能够与miRNA特异性结合的DNA分子信标，培养细胞一段时间，通过检测荧光强度来分析细胞实时分泌miRNA情况，该检测方法在单细胞液滴中加入分子信标，无需对样本进行PCR扩增，即可原位、动态检测单细胞分泌的miRNA，使得研究者以最少的时间、成本、精力和专业知识对单细胞分泌miRNA进行原位动、态检测，该方法有望广泛应用于单细胞水平的实时检测。

技术领域

本发明属于单细胞分泌物分析技术领域，具体涉及一种原位、动态检测细胞分泌miRNA的方法。

背景技术

细胞分析可以得到关于细胞特征、行为和功能的准确、深入的信息，为现代生物学和临床科学提供了重要的见解。细胞群作为一个整体，通过不同细胞类型在不同时间和尺度上的多层次相互作用产生可靠的生物反应。因此，细胞分析既可以在系统层面进行，以测量整个细胞群的平均反应，也可以在单细胞层面通过揭示高度异质性细胞亚群的分层和相互关联的属性。即使在看似同质的细胞亚群中，也存在着细胞周期、活性和随机基因表达的异质性。单细胞的分泌物分析对于充分理解细胞功能异质性和揭示细胞间通讯和相互作用的潜在机制至关重要。以单细胞分辨率检测分泌物的动态信息反映了生理过程中单个细胞的精确、实时的功能状态。这种测量在单细胞分析中仍然非常具有挑战性，需要高度集成的系统才能够执行单细胞分离和随后的实时分泌物检测。

microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的，长度约为19-25个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们是基因表达的转录后调控因子，能够调控基因的表达和翻译后修饰。miRNA的表达是与正常生理和许多疾病发病机制是密切相关的，是复杂生物过程中的关键调控因子。单细胞分泌的miRNA的分析对于了解细胞增殖、分化、新陈代谢，肿瘤的侵袭、转移有重要的意义。目前的单细胞miRNA分析依赖于PCR扩增，操作繁琐，成本高，且不能动态检测单细胞分泌的miRNA。

分子信标是一种由荧光基团和淬灭基团共同修饰的寡核苷酸链，呈茎环结构。由四部分组成：环状区、茎干区、荧光基团、淬灭基团。环状区可以和靶标miRNA特异性结合，茎干区由5～8个碱基对组成，茎干区的两个末端分别修饰荧光基团和淬灭基团。当没有靶标miRNA时，荧光基团和淬灭基团距离近，由于荧光共振能量转移，荧光被淬灭，分子信标不发荧光。当存在靶标miRNA时，环状区可以和靶标miRNA特异性结合，茎环结构打开，荧光基团与淬灭基团远离，荧光共振能量转移消失，在激发光的激发下，分子信标会标发出荧光。

虽然现有技术中能够实现单细胞分泌物动态检测，但是通常需要单细胞分离和随后的实时分泌物检测的高度集成的系统，设备复杂，费用昂贵，到目前为止，研究开发一种无需复杂设备、操作简单方便的原位、动态检测细胞分泌miRNA的方法的相关研究还未见报道。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的是提供了一种原位、动态检测细胞分泌miRNA的方法，该方法无需负责设备、操作简单方便，只需要一台小型的涡旋仪即可产生高通量的单细胞液滴，所述单细胞液滴内包裹细胞及分子信标，所述检测方法无需PCR扩增，可以大范围推广使用。

本发明目的是通过以下方式实现：

本发明提供一种原位、动态检测细胞分泌miRNA的方法，所述方法为将单细胞和分泌miRNA检测试剂封装在通过涡旋震荡生成的油包水液滴中，所述的分泌miRNA检测试剂为两端分别修饰荧光基团和淬灭基团且能够与miRNA特异性结合的DNA分子信标，培养细胞一段时间，通过检测荧光强度来分析细胞实时分泌miRNA情况。

基于上述技术方案，进一步地，所述的分泌miRNA包括但不限于miR-21、miR-27a和miR-375。