[发明专利]一种检测草莓中苯醚甲环唑时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，公开了一种检测草莓中苯醚甲环唑时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：S1、苯醚甲环唑半抗原制备；S2、苯醚甲环唑抗体的制备；S3、苯醚甲环唑抗体‑时间分辨荧光微球制备；S4、荧光微球垫制备：将苯醚甲环唑抗体‑时间分辨荧光微球均匀喷涂在聚酯纤维层上；S5、反应膜制备：将苯将苯醚甲环唑包被原和羊抗鼠IgG抗体包被到硝酸纤维素膜上，分别构成检测线和质控线；S6、试纸组装。本发明制得的试纸对苯醚甲环唑的检测灵敏度高，可以检测出草莓中较低浓度的苯醚甲环唑；能够特异性的检测草莓中的苯醚甲环唑，且准确率高；同时稳定性好，保存大于12个月。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体是一种检测草莓中苯醚甲环唑时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法和应用。

背景技术

草莓白粉病由子囊菌亚门真菌羽衣草单囊壳菌侵染所致，是草莓生产上的重要病害之一，主要为害草莓的叶片和果实，发生严重时病叶率在45%以上，病果率在50%以上；由于苯醚甲环唑杀菌剂具有高效、广谱﹑低毒、残效期长、良好的内吸传导性能等特点,广泛应用对于草莓白粉病的防治，由于部分果农使用不规范，造成了草莓果实中残留的苯醚甲环唑超标，为了提高食品的安全，这就需要对草莓中残留的苯醚甲环唑进行检测；以防止苯醚甲环唑超标的草莓果实流入市场。

中国专利公开了一种检测苯醚甲环唑的试纸条及方法（授权公告号CN112067814A），该专利技术包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上具有包被有苯醚甲环唑半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线，所述结合物释放垫上喷涂有苯醚甲环唑单克隆抗体-胶体金标记物；有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、适于大批量样本筛查等优点，但是其，对苯醚甲环唑的特异性不佳；且不能进行长时间保存，稳定性较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测草莓中苯醚甲环唑时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种检测草莓中苯醚甲环唑时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

S1、苯醚甲环唑半抗原制备：苯醚甲环唑半抗原制备：利用4-（3-甲基-4-氯苯）氧基苯乙酮、1,2-丙二醇、对甲基苯磺酸、溴素、DMF、三唑钾盐、高锰酸钾、二氯亚砜，并通过溶解、蒸馏、结晶、提纯后，得到苯醚甲环唑半抗原；

S2、苯醚甲环唑抗体的制备：将苯醚甲环唑半抗原与牛血清蛋白偶联，得到苯醚甲环唑免疫原；再用苯醚甲环唑免疫原免疫小鼠，接着将小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选；得到苯醚甲环唑抗体；

S3、苯醚甲环唑抗体-时间分辨荧光微球制备：将N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到2-吗啉乙磺酸中，配制成混合溶液；再加入稀土荧光络合物微球和苯醚甲环唑抗体；得到苯醚甲环唑抗体-时间分辨荧光微球；

S4、荧光微球垫制备：将聚酯纤维层浸泡于含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，浸泡结束后，低温烘干；再将苯醚甲环唑抗体-时间分辨荧光微球均匀喷涂在聚酯纤维层上，再次低温烘干后，得到荧光微球垫；

S5、反应膜制备：将苯醚甲环唑半抗原与卵清蛋白偶联，得到苯醚甲环唑包被原，再将苯醚甲环唑包被原包被到硝酸纤维素膜上构成检测线；将羊抗鼠IgG抗体包被到硝酸纤维素膜上构成质控线，得到反应膜；

S6、试纸组装：将吸水垫、反应膜、荧光微球垫和样品垫按顺序粘贴在底板上，再切割成3～4mm宽的试纸条，即得到时间分辨荧光免疫层析试纸条，将其置于锡箔袋中，放入干燥剂密封保存即可。

作为本发明再进一步的方案：所述S1步骤中苯醚甲环唑半抗原的制备方法包括以下步骤：