[发明专利]一种检测草莓中苯醚甲环唑时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法和应用

权利要求书

1.一种检测草莓中苯醚甲环唑时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、苯醚甲环唑半抗原制备：利用4-（3-甲基-4-氯苯）氧基苯乙酮、1,2-丙二醇、对甲基苯磺酸、溴素、DMF、三唑钾盐、高锰酸钾、二氯亚砜，并通过溶解、蒸馏、结晶、提纯后，得到苯醚甲环唑半抗原；

S2、苯醚甲环唑抗体的制备：将苯醚甲环唑半抗原与牛血清蛋白偶联，得到苯醚甲环唑免疫原；再用苯醚甲环唑免疫原免疫小鼠，接着将小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选；得到苯醚甲环唑抗体；

S3、苯醚甲环唑抗体-时间分辨荧光微球制备：将N-羟基丁二酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到2-吗啉乙磺酸中，配制成混合溶液；再加入稀土荧光络合物微球和苯醚甲环唑抗体；得到苯醚甲环唑抗体-时间分辨荧光微球；

S4、荧光微球垫制备：将聚酯纤维层浸泡于含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，浸泡结束后，低温烘干；再将苯醚甲环唑抗体-时间分辨荧光微球均匀喷涂在聚酯纤维层上，再次低温烘干后，得到荧光微球垫；

S5、反应膜制备：将苯醚甲环唑半抗原与卵清蛋白偶联，得到苯醚甲环唑包被原，再将苯醚甲环唑包被原包被到硝酸纤维素膜上构成检测线；将羊抗鼠IgG抗体包被到硝酸纤维素膜上构成质控线，得到反应膜；

S6、试纸组装：将吸水垫、反应膜、荧光微球垫和样品垫按顺序粘贴在底板上，再切割成3～4mm宽的试纸条，即得到时间分辨荧光免疫层析试纸条，将其置于锡箔袋中，放入干燥剂密封保存即可。

2.根据权利要求1所述的一种检测草莓中苯醚甲环唑时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中苯醚甲环唑半抗原的制备方法包括以下步骤：

S11、在圆底烧瓶中将4-（3-甲基-4-氯苯）氧基苯乙酮溶于甲苯，加入1,2-丙二醇和对甲基苯磺酸，温度升至120℃反应，用分水器分出反应生成的水，当不再有水产生时，反应结束，将反应液冷却至室温，将反应液用分液漏斗分出下层溶液，用饱和食盐水洗三次，再用蒸馏水洗涤两次，得淡黄色油状液体即为化合物A；

S12、将化合物A溶于环己烷，室温搅拌下滴加计量好的溴素的三分之一，滴加完毕后，待反应液红色退去，温度降至20℃，继续滴加，滴加完毕后，油浴加热回流反应，TLC法检测，反应完全后，将反应液冷却至室温，减压蒸馏去除溶剂得黄褐色油状液体，即为化合物B；

S13、将化合物B溶于DMF，加入三唑钾盐，150℃反应，用TLC法检测反应，8h后反应结束，将反应液减压蒸馏回收DMF，然后 加入水和甲苯，用分液漏斗提取出产品粗品，用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏去除溶剂，得黄褐色固体，用乙醇重结晶，得淡黄色针状晶体，即为化合物C；

S14、将化合物C溶于乙腈，加入适量的水，使溶液刚好澄清，冰浴下分批加入高锰酸钾，加毕，撤去冰浴，室温反应4h，将反应液过滤，滤饼用乙腈洗涤两次，取滤液，减压蒸馏，去除乙腈，剩余物溶于乙酸乙酯中，干法上样过柱提纯，收集主要的紫外点组分，减压蒸馏脱溶后，得白色固体，即为化合物D；

S15、将化合物D溶于二氯亚砜，加入3滴DMF，116℃反应4h，反应完全后，将反应液减压蒸馏，用正己烷带出剩余的少量二氯亚砜，得化合物E，将其溶于无水四氢呋喃，低温冷却至0℃备用，另取4-氨基丁酸溶于1NNaOH,低温冷却至0℃，将化合物E的四氢呋喃溶液分5批加入4-氨基丁酸的氢氧化钠溶液中，每一次至少间隔10min，加毕，保持冰浴反应，大约3h后，反应完全，将反应液减压蒸馏去除四氢呋喃，往剩余物中加入适量的水，用乙酸乙酯提取三次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，蒸干，产品用硅胶柱层析提纯，得淡黄色固体，即为苯醚甲环唑的半抗原。