[发明专利]一株生产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌突变株及其应用

说明书

本发明提供了一株生产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌C3‑2(Vibrio furnissii C3‑2)，该菌株于2023年03月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2023411，地址：中国，武汉，武汉大学；弗氏弧菌C3‑2所产生的褐藻胶裂解酶的酶活力较野生菌株提升了40％以上，且褐藻胶裂解酶对碱性环境的耐受性更强，同时遗传特性稳定，具有良好的工业发展前景。

技术领域

本发明涉及微生物诱变育种技术领域，具体是一株生产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌突变株及其应用。

背景技术

褐藻胶是存在于褐藻细胞壁中的一种高分子多糖，主要由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronate acid，M)与其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid，G)通过1,4糖苷键随机排列聚合而成。目前，褐藻胶已成为产量仅次于纤维素的可持续发展资源，具有巨大的应用价值。褐藻胶裂解酶是制备褐藻寡糖的关键工具酶，褐藻胶裂解酶通过β消除反应作用单体间的1,4-糖苷键；微生物来源的褐藻胶裂解酶大多数是同时具备降解两种糖醛酸片段的能力，其降解产生的不饱和键可能会改善褐藻寡糖的某些理化性质，从而提高寡糖的生物活性。

除褐藻外，少数细菌如假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、弧菌属(Vibrio)也会产生褐藻胶裂解酶；由于现有微生物的产酶量少、酶活低，限制了其进一步开发应用，因此寻找新的高效产酶菌、提高菌株发酵酶活力是迫切需要解决的问题。

诱变是提高微生物发酵产酶水平的有效方法之一，已成为微生物诱变育种的重要技术。常温常压等离子体(Atmosphe ricandroom temperature plasma，ARTP)诱变育种，是指在常温常压环境下通过产生高活性的等离子体射流，致使细胞受到多样性的损伤，其富含高能化学活性粒子，可对微生物造成遗传物质的损伤、引起细胞膜的结构和通透性改变、引起蛋白结构的改变等，从而引起基因突变，导致微生物性状和代谢产生变化；硫酸二乙酯(diethyl sulfate，DES)是一种化学诱变剂，可以诱导微生物的碱基发生变化，引起基因突变。ARTP和DES诱变育种都是一种微生物基因组高效快速诱变育种技术，操作简便、成本低、效率高。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一株生产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌突变株，申请人以弗氏弧菌C1(Vibrio furnissii C1)为出发菌株，经过四次ARTP诱变和两次DES诱变，筛选获得褐藻胶裂解酶产量明显提高的突变菌株，酶活力较野生菌株提升了41％，且遗传特性稳定，将其命名为弗氏弧菌C3-2(Vibrio furnissii C3-2)。

本发明技术方案如下：

一株弗氏弧菌C3-2(Vibrio furnissii C3-2)，该菌株于2023年03月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2023411，地址：中国，武汉，武汉大学。

其中，所述弗氏弧菌C3-2是以弗氏弧菌C1为出发菌株，通过ARTP诱变和DES诱变的方法筛选获得。

优选的，所述弗氏弧菌C3-2的培养方法，包括如下步骤：

将弗氏弧菌C3-2划线分纯后，挑取单菌落接种于种子培养基中，28±2℃，150～200r/min条件下恒温培养，得弗氏弧菌C3-2菌液。

优选的，所述种子培养基的组分为：蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，海藻酸钠2.0g，磷酸高铁0.01g，海水缓冲液1L，pH 7.4～7.6；其中，所述海水缓冲液的组分为：海盐30g，去离子水1L。

上述弗氏弧菌C3-2可以应用于生产褐藻胶裂解酶，且褐藻胶裂解酶产量相比于原始菌株弗氏弧菌C1明显提高。

优选的，所述弗氏弧菌C3-2生产褐藻胶裂解酶的方法，包括如下步骤：