[发明专利]一种构建测序文库的方法及应用

权利要求书

1.一种构建测序文库的方法，包括：

S1、将核酸样本进行末端修复和加腺苷酸尾，得到加腺苷酸尾产物；

S2、将所述加腺苷酸尾产物与接头进行连接，得到接头连接产物；

其中，末端修复和加腺苷酸尾为连续进行的；

其中，将所述加腺苷酸尾产物与接头进行连接为连续进行的；

其中，将所述加腺苷酸尾产物与接头进行连接采用第二缓冲溶液，所述第二缓冲溶液不包括二价阳离子，且采用低分子量PEG。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在S2之后，所述方法还包括：S3、将所述接头连接产物进行PCR扩增；

优选地，将所述接头连接产物进行PCR扩增为连续进行的；

优选地，在PCR扩增完成前，无需进行纯化。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在S1之前，所述方法还包括将核酸样本进行片段化处理，得到片段化DNA。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述第二缓冲液包括：Tris缓冲液、二硫苏糖醇和低分子量PEG，且所述第二缓冲液不包括二价阳离子；

更优选地，所述第二缓冲液包括：60-70mM的Tris缓冲液、1-4mM的二硫苏糖醇、15体积％-40体积％的低分子量PEG，pH为7-9。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，将核酸样本进行末端修复和加腺苷酸尾处理采用第一缓冲溶液；

优选地，所述第一缓冲溶液包括：Tris缓冲液、二价阳离子、一价阳离子、ATP和dNTP；

更优选地，所述第一缓冲液包括：40-75mM的Tris缓冲液、20-100mM的二价阳离子、200-1000mM的一价阳离子、5-25mM的ATP和2.5-25mM的dNTP，pH为7-10；

更进一步优选地，所述第一缓冲液还包括表面活性剂；优选地，以第一缓冲液的总重量为基准，所述表面活性剂的含量为0.01-2质量％；更优选地，所述表面活性剂选自聚乙二醇辛基苯基醚、Tween20、Tween40和Tween60中的至少一种。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述Tris缓冲液为Tris-盐酸缓冲液和/或Tris-醋酸缓冲液；和/或，

所述二价阳离子选自Mg²⁺、Mn²⁺和Ca²⁺中的至少一种；和/或，

所述低分子量PEG的分子量为200-1000，更优选地，所述低分子量PEG选自PEG200、PEG400、PEG600、PEG800和PEG1000中的至少一种。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，将核酸样本进行末端修复和加腺苷酸尾的步骤还采用第一酶；

优选地，所述第一酶为DNA聚合酶和加腺苷酸尾酶；

优选地，所述DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶和/或T4DNA聚合酶；

优选地，所述加腺苷酸尾酶选自klenow(3’-5’exo-)、klenowfragement和T4PolynucleotideKinase中至少一种；

优选地，所述DNA聚合酶的用量为0.2-0.6U/μL；

优选地，所述加腺苷酸尾酶的用量为0.2-0.5U/μL。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，将所述加腺苷酸尾产物与接头进行连接的步骤还采用第二酶；

优选地，所述第二酶为T4DNAligase；

优选地，所述第二酶的用量为100-300U/μL。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，末端修复和加腺苷酸尾的反应条件包括：16-40℃下5-30分钟和65-75℃下10-30分钟；和/或，

将所述加腺苷酸尾产物与接头进行连接的反应条件包括：15-25℃下20-40分钟；和/或，

所述接头的浓度为0.1-50μmol/L。

10.权利要求1-9中任一项所述的构建测序文库的方法在生物技术，尤其在基因测序中的应用。