[发明专利]一种基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法及成像方法

说明书

本发明提供一种基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法及成像方法。本发明基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法包括如下步骤：固定荧光基准标记物，使每个生物样品的成像视场有一定数量的荧光基准标记物；对荧光基准标记物和生物样品进行单分子定位成像，并对所述荧光基准标记物定位；荧光基准标记物筛选：对多颗荧光基准标记物的定位轨迹取平均，作为初始漂移轨迹，基于所述初始漂移轨迹，筛选能够用于漂移矫正的荧光基准标记物作为定位荧光基准标记物；利用定位基准标记物的定位数据重新计算漂移轨迹；基于重新计算的漂移轨迹，对生物样品的成像序列进行漂移矫正。本发明的有益效果为：提高目标分子的定位精度，有效提高了成像性能。

技术领域

本发明涉及生物样品成像技术领域，具体涉及一种基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法，还涉及一种采用所述基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法的成像方法。

背景技术

由于单分子定位显微镜（SMLM）具有前所未有的分辨率，其对细胞的成像过程提供了重要的见解。SMLM方法，例如光激活定位显微镜（PALM）和随机光学重建显微镜（STORM），通过在时间上切换荧光分子的发射状态来克服衍射极限，以便每次都可以很好地识别和定位来自单个荧光分子的点扩散函数（PSF）以找到其中心位置，这使得定位精度受限于信噪比（SNR）而不是光的波长。

尽管荧光分子的光开关能够精确定位它们的位置，但由于需要数千帧的成像序列来重构超分辨率图像，成像时间延长至几十分钟甚至是数小时。在采集过程中，光学装置的机械运动，例如机械部件的振动和弛豫，使得样品和物镜之间产生相对移动。这种漂移会严重降低重建图像的分辨率。为了进行漂移矫正，常用的方法是使用基准标记物，例如可以在整个实验中保持发光的荧光珠，测量和跟踪基准标记（附在盖玻片上）与图像视野（由物镜设置）的相对位置。通常，基准标记是一个亚微米大小的珠子，它应该足够亮，这样它的位置就可以比成像的单个分子的定位精度更好的精度来确定。荧光珠固定在显微镜盖玻片上，其位置由单分子定位算法进行定位，然后通过计算这些荧光珠的位移轨迹来估计载物台漂移。这样就可以通过减去估计的漂移量来矫正每一帧中目标分子的定位。

在漂移矫正中使用基准标记的一个关键假设是基准标记相对于样本是静态的。然而，基准标记是否静止一直是一个悬而未决的问题。珠子的热运动已在先前的一些研究中有所报道。但荧光珠在SMLM中常规使用的不同固定条件下是否保持静态的，以及它们的运动如何影响漂移的矫正，尚未得到充分研究。

基准标记物的运动会大大降低漂移矫正的准确性，导致基准标记物或单个分子的定位精度变差。因此，基准标记物的运动筛选在漂移矫正中是非常有必要的，可确保高精度漂移矫正和良好的成像性能，为了研究这个问题，应该开发一种能够有效评估基准标记物运动幅度、并对基准标记物进行漂移矫正和筛选的方法。

发明内容

为解决现有技术中的问题，本发明提供一种基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法，还提供一种采用所述基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法的成像方法，从而提高目标分子的定位精度，提高成像性能。

本发明基于基准标记物的漂移矫正与筛选方法，包括如下步骤：

S1：固定荧光基准标记物，使每个生物样品的成像视场有一定数量的荧光基准标记物；

S2：对荧光基准标记物和生物样品进行单分子定位成像，并对所述荧光基准标记物定位；

S3：荧光基准标记物筛选：对多颗荧光基准标记物的定位轨迹取平均，作为初始漂移轨迹，基于所述初始漂移轨迹，筛选能够用于漂移矫正的荧光基准标记物作为定位荧光基准标记物；

S4：利用定位基准标记物的定位数据重新计算漂移轨迹；

S5：基于重新计算的漂移轨迹，对生物样品的成像序列进行漂移矫正。