[发明专利]马兜铃酸D的对照品的制备方法

权利要求书

1.一种马兜铃酸D的对照品的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

酸碱处理工序，将天仙藤药材总提取物粉末或浸膏，以3～7倍重量的pH值8～9的碱化的水溶液混悬，静置0.5～1.5小时后，再以0.8～4倍体积的有机溶剂萃取，回收水相，加入酸性水溶液，调节pH至3～4，用0.8～4倍体积的体积有机溶剂萃取，回收有机相，浓缩得到天仙藤总提取物II，

聚酰胺纯化工序，将天仙藤总提取物II上样于100～200目聚酰胺柱层析，以乙酸乙酯：甲醇＝30:1～10:1洗脱液逐渐增加极性进行洗脱，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥，天仙藤粗提物I，其中，甲醇中可选地含有8体积％～12体积％的甲酸以及8体积％～12体积％的水；

反相色谱纯化工序：天仙藤粗提物I上样至反相色谱柱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.7:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液在50℃以下的温度减压浓缩，干燥得到马兜铃酸D的粗品II溶液，乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂中可选地含有0.1％～0.3％乙酸；

溶剂处理工序，将反相色谱纯化工序中所得到马兜铃酸D的粗品II溶液在50℃以下的温度浓缩，得到析出物，淋洗，干燥之后获得马兜铃酸D的对照品。

2.根据权利要求1所述的马兜铃酸D的对照品的制备方法，其特征在于，

所述天仙藤药材总提取物溶液的制备方法如下，将天仙藤药材粉碎，加入5～20倍重量的醇系水溶液，室温浸泡或者热回流提取10～60小时，过滤，浓缩，得天仙藤药材总提取物溶液。

3.根据权利要求1所述的马兜铃酸D的对照品的制备方法，其特征在于，

反相色谱纯化工序先进行中低压反相色谱纯化工序，再进行高压反相色谱纯化工序，其中

中低压反相色谱纯化工序：将天仙藤粗提物I上样至反相色谱柱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以0.5～1Mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.6:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液在50℃以下的温度减压浓缩，去除其中的乙腈或甲醇，得到含有马兜铃酸D的粗品II-1；

高压反相色谱纯化工序：将马兜铃酸D的粗品II-1上样至反相色谱柱，用可选地含有0.1％～0.3％乙酸的乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以1～15Mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.67:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，得到马兜铃酸D的粗品II溶液。

4.根据权利要求1所述的马兜铃酸D的对照品的制备方法，其特征在于，

还包括精制工序，将溶剂处理纯化工序中所得的马兜铃酸D的对照品，利用重结晶方法进行纯化精制。

5.根据权利要求4所述的马兜铃酸D的对照品的制备方法，其特征在于，

精制工序中，将反相色谱纯化工序中所得到马兜铃酸D粗品II用醇系溶剂溶解，于-30℃～0℃结晶，过滤获得结晶，再进行2次以上重结晶。

6.根据权利要求2所述的马兜铃酸D的对照品的制备方法，其特征在于，

醇系的水溶液为60％～90％的甲醇水溶液或者60％～90％的乙醇水溶液。

7.根据权利要求1所述的马兜铃酸D的对照品的制备方法，其特征在于，

酸碱处理工序，酸化水溶液为8wt％～10wt％的盐酸，碱性溶液为碳酸氢钠溶液。

8.根据权利要求1所述的马兜铃酸D的对照品的制备方法，其特征在于，

聚酰胺纯化工序，以乙酸乙酯：甲醇＝20:1～10:1洗脱液逐渐增加极性进行洗脱，甲醇中含有9体积％～10体积％的甲酸以及9体积％～10体积％的水。