[发明专利]儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法。本发明提供了儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒中包括了可直接利用的磁悬液、淋洗液和洗脱液；将所述磁悬液用于样本中儿茶酚胺代谢物的提取，操作简单直接，使用前不需要通过活化、平衡；且本发明对样品前处理步骤进行了优化，避免了蛋白沉淀的发生，处理步骤更加简单快速，更有利于临床样本中儿茶酚胺代谢物浓度的检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法。

背景技术

儿茶酚胺类物质为一类重要的神经递质或激素物质，是正常生理过程中重要的信号介质，同时在病理过程中也出现其含量的相应变化。儿茶酚胺原型主要为肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)，其代谢物分别为变肾上腺素(MN)、去甲变肾上腺素(NMN)和3-甲氧酪胺(3-MT)。儿茶酚胺代谢物与原型物质相比，其半衰期更长，其性能更加稳定。

目前常见的测定血浆中儿茶酚胺代谢物的金标准是液相色谱-串联质谱法，其前处理方式主要有固相萃取法、磁珠法。

液相色谱-串联质谱结合了液相色谱的分离能力和质谱的定量检测能力，常用的串联质谱为三重四极杆。其检测原理为流动相携带待测物流经色谱柱，经色谱柱分离后，流出的物质先后在离子源内形成带电离子，经过四极杆的筛选后最终测定物质对应的m/z实现定量分析。液相色谱-串联质谱检测的是物质本身，因此具有更高的特异性和灵敏度，分析时长更短，但是对样本的前处理过程要求较高。

固相萃取原理是样品基质各组分在萃取小柱或萃取板上的保留能力不同，使目标分析物保留并洗脱下来，同时去除样品基质中的杂质(干扰物)，分析物被浓缩。由于是特定性的选择对应的固相萃取小柱或萃取板，其净化程度非常之高，且减少了基质效应。但是这种方法前处理操作也比较复杂，且固相萃取板成本较高，另外通常需要借助于正压或负压以及氮吹装置，较难实现自动化。

磁珠法是近几年较为热门的前处理方法，在临床诊断领域的应用包括核酸如RNA、DNA、mRNA的扩增和检测技术、质谱分析法以及蛋白质的电/化学发光测定等。其原理是指是运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良修饰后，制备成超顺磁性微球，该微球表面加以修饰的相应功能基团能与目标分析物特异性地识别和高效结合。现有磁珠法试剂盒的缺点：试剂盒在使用前，磁珠需要先活化、平衡，导致样本前处理周期长；前处理淋洗过程中有机试剂的加入与残留的样本有发生蛋白沉淀的风险。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供儿茶酚胺代谢物的提取和检测试剂盒及检测方法。

本发明提供了提取和检测儿茶酚胺代谢物的试剂盒，其包括淋洗液、洗脱液和磁悬液，

所述洗脱液为甲酸和乙腈的混合液；

所述磁悬液的制备方法为：利用有机溶剂处理磁珠后，以磷酸盐缓冲液重悬，制得所述磁悬液；

所述有机溶剂包括甲醇和乙腈的混合液、甲醇或乙腈中的任意一种。

进一步的，本发明所述的试剂盒中，

所述淋洗液为甲醇溶液；

所述洗脱液中，甲酸的体积占比为0.2％～10％，优选为1％～5％(例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％)，当甲酸体积占比过高时，会产生比较严重的溶剂效应，影响后续质谱检测的图谱峰形，在本发明中，优选的，甲酸和乙腈的体积比为2:98；

所述磁悬液中磁珠的浓度为5mg/mL；

所述磁悬液中的磁珠为羧基磁珠，所述羧基磁珠的粒径为30～50μm；该款磁珠粒径较大，便于后续磁吸过程中充分磁吸集中，避免在上清液中残留磁珠而堵塞色谱柱，影响后续色谱柱性能；