[发明专利]一种冬油菜越冬记忆候选基因的鉴定方法及应用

说明书

本发明公开了一种冬油菜越冬记忆候选基因的鉴定方法，涉及冬油菜越冬记忆机制解析技术领域，本发明对白菜型冬油菜冬前期、越冬期、返青期的根颈部进行取样，通过转录组调查基因的表达模式，对差异基因表达趋势进行分析，从而发现潜在的冬油菜越冬记忆候选基因。本发明方法是在冬油菜不同生长发育时期，采集自然降温状态下冬油菜根颈部组织；采用转录组学获得冬油菜根颈部基因定量表达结果，对冬油菜根颈部不同时期的差异表达基因进行鉴定后分析其表达趋势，获得的“+,+”、“‑,‑”、“‑,+”、“+,‑”4种显著富集趋势可认定为越冬记忆候选基因，可用于冬油菜越冬能力提高、抗寒品种(系)选育、抗寒性改良等方面。

技术领域

本发明涉及冬油菜越冬记忆机制解析技术领域，更具体的说是涉及一种冬油菜越冬记忆候选基因的鉴定方法及应用。

背景技术

冬油菜作为北方地区良好的冬春季覆盖作物和唯一的越冬油料作物，其种植除可增加油料作物播种面积和冬春季土表覆盖度外，秸秆还田还可以有效增加土壤有机质含量，提高复种指数和下茬作物产量。同时冬油菜种植避免了与其他油料作物竞争土地，因此在我国北方地区开展冬油菜种植，除可提高菜籽油的供给以缓解食用油短缺的问题外，亦可减轻土壤风蚀，增加农民收入，改善生态环境。

冬油菜秋季播种，越冬期长达半年，因此冬油菜生产的首要考虑是保证安全越冬。根作为北方冬油菜越冬期间唯一存活的器官，是决定冬油菜能否越冬的关键器官，越冬期间营养物质主要储存在根颈部。

目前，北方寒区针对冬油菜遗传改良的主要研究方向是抗寒性方面的研究。主要集中在低温胁迫的生理生化响应方面，对冬油菜是如何感知越冬期的来临，如何“记住”越冬期以通过春化调节生长发育与开花期之间的平衡等机制研究较少，限制了提升冬油菜越冬能力以及抗寒系品种的选育等研究效率。

因此，如何筛选获得冬油菜越冬基因是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种冬油菜越冬记忆候选基因的鉴定方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种冬油菜越冬记忆候选基因的鉴定方法，对白菜型冬油菜冬前期、越冬期、返青期的根颈部进行取样，通过转录组调查基因的表达模式，对差异基因表达趋势进行分析，从而发现潜在的冬油菜越冬记忆候选基因；具体包括以下步骤：

(1)取样：自冬油菜田间生长至六叶期开始采样，采样间隔时间20-22d；

(2)提取冬油菜根颈部RNA，构建cDNA文库；

(3)采用Illumina测序平台对cDNA文库进行测序；

(4)筛选组间差异表达基因；

(5)对差异基因表达趋势进行分析，确定冬油菜根颈部中潜在的越冬记忆候选基因，进行功能富集分析。

作为优选的技术方案，步骤(1)所述取样在10:30-11:30之间完成，六叶期为冬前期，定义为S1，之后每隔20-22d取样一次，为越冬期，定义为S2-S5，返青后取样为返青期，定义为S6；

每个时期至少采集3株根系洗去表面泥土，去离子水冲洗后纱布吸干水分，取根颈部组织切碎后混合取样，每个时期采集3个生物学重复，液氮速冻后保存于-80℃备用。

作为优选的技术方案，步骤(2)所述提取冬油菜根颈部RNA的方法为：取100mg根颈部组织，利用植物总RNA提取试剂盒(DP432)按照说明书步骤进行提取；接着用无RNA酶的DNA酶对每个样本所提RNA中的基因组DNA进行消化，最后用NanoDrop 2000分光光度计鉴定RNA的纯度和浓度，并用Agilent 2100Bioanalyzer评估RNA完整性。