[发明专利]中甸百脉根快速繁殖方法及应用

说明书

本发明公开一种中甸百脉根快速繁殖方法及应用，方法步骤包括：外植体选择与消毒，愈伤组织诱导，不定芽分化，芽的壮苗培养，生根培养。本发明以百脉根幼苗叶片为外植体，对其进行愈伤组织的诱导、不定芽的分化诱导、壮苗与生根培养，并确定其理想培养条件，建立高效的百脉根的无性繁殖体系，为百脉根遗传转化研究提供一个坚实的基础。本发明具有取材方便、操作简单、培养周期短等特点，为中甸百脉根的工厂化生产提供一套切实可行的组培快繁技术和程序。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种中甸百脉根（ Lotus corniculatus L. cv. Zhongdian）快速繁殖方法及应用。

背景技术

中甸百脉根（ Lotus corniculatus L. cv. Zhongdian）是豆科百脉根属多年生牧草，别名鸟足豆、瘠地苜蓿，适应云南省迪庆州海拔2500-3500 m，年均温3-6℃，年降雨400-600 mm的高寒地区及气候条件相近地区。该种营养价值高，适口性好，再生能力强，具有耐牧的特点，可青贮、刈割及放牧利用，是牛、马、兔等家畜的优良牧草。中甸百脉根茎细叶多，草产量高，适口性好；耐寒，耐涝，不易裂荚，适宜放牧和刈制青干草，也是良好的蜜源和水土保持植物。

中甸百脉根植株高可达50cm，具主根，茎丛生，实心，羽状复叶，叶片纸质，斜卵形至倒披针状卵形，中脉不清晰；小叶柄甚短，伞形花序；花集生于总花梗顶端，花梗短，苞片叶状，与萼等长，宿存：萼片钟形，萼齿狭三角形，花冠黄色或金黄色，旗瓣扁圆形，花丝分离；花柱直，子房线形，荚果直，褐色，种子细小，卵圆形，5-9月开花，7-10月结果。

野生百脉根苗期生长缓慢，且荚果易开裂，种子落粒性强，种子硬实率高，建立组培快繁体系可从根本上解决这一问题。本发明通过组织培养建立一套完整的再生体系，对百脉根的进一步改良利用有着极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对背景技术中存在的问题，提供一种中甸百脉根离体再生方法，各阶段采用不同的优化培养基，使之在野生种易裂荚，种子硬实率高的情况下能快速繁殖，使该物种的优良性状的保存能够得到保障，提高了中甸百脉根的苗期成活率，为中甸百脉根的可持续利用提供了组培种苗繁育基础。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：中甸百脉根快速繁殖方法，步骤包括：

（1）外植体选择与消毒：选择正常生长、无病无害的中甸百脉根幼苗叶片为外植体，用洗洁剂清洗干净，再用自来水冲洗，然后转至超净工作台上，用75%的乙醇溶液消毒3-5 s，无菌水洗2-3次，利用0.1%升汞溶液消毒5-8 min，再用无菌水清洗3次，置于滤纸上晾干备用；

（2）愈伤组织诱导：将消毒好的叶片剪成0.5cm²大小，接种至愈伤组织培养基中，控制pH为5.8，培养温度25±2℃，光照12-14 h/d、光强度2000Lx，培养6-8天使叶片切口处均长出紧密的乳白色愈伤组织；

（3）不定芽分化：愈伤组织继续在上述培养基和培养条件下继续培养10-15天，使愈伤组织分化出小芽；

（4）芽的壮苗培养：分化出的不定芽连同愈伤组织切下，接入壮苗培养基中，pH为5.8培养15-20天使芽高为5-8 cm；

（5）生根培养：将步骤（4）培壮后的小苗单株切下，接入生根培养基中，pH为5.8，温度为25±2℃，光照时间为12 h/d，光照强度为2000 Lx，继续培养20-30天使幼苗生长出3-4cm长的不定根；

（6）生根苗驯化：将百脉根生根苗洗净基部培养基，移植于珍珠岩+蛭石（1:1）的混合基质中，在遮阳率为75%的环境下驯化，前5天保持小环境空气湿度为100%，后逐步降低空气湿度，驯化期间保持基质湿度在60%。