[发明专利]一种转基因百脉根组培苗的培育方法

摘要

本发明公开了一种转基因百脉根组培苗的培育方法，包括以下步骤：(1)种子预处理及消毒；(2)种子萌发；(3)农杆菌转化及培养；(4)共培养；(5)重生；(6)选择培养；(7)芽诱导和延长；(8)根诱导和延长。本发明通过在质粒上连接百脉根钙调蛋白基因，然后借由农杆菌介导转化百脉根，再通过转基因组培实验获得过表达百脉根植株。本发明成本低，操作简单，成活率和转化率均较高。

主权项

1.一种转基因百脉根组培苗的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用砂纸轻柔摩擦种子，然后对其进行消毒；(2)种子萌发将消毒后的种子放置于浸湿的无菌滤纸上，置于室温、黑暗条件下，直至百脉根下胚轴长度为1.5‑2cm；(3)农杆菌转化及培养将百脉根钙调素基因插入质粒中得到重组质粒，将重组质粒转化农杆菌，然后接种在YEP培养基中，于28℃下培养，然后挑选阳性菌，在选择培养基中划线培养，培养温度为28℃，培养时间为2‑3天；(4)共培养将步骤(3)所得菌置于YEP培养基中，制成细胞悬浮液，然后将5‑8层滤纸用共培养基浸泡，然后加入细胞悬浮液，将步骤(2)所得幼苗下胚轴切成0.5‑0.6cm长，置于浸泡过细菌的滤纸上，在24℃，黑暗条件下孵育4‑5天；(5)重生将含有下胚轴外植体的最上层滤纸从共培养基转移至再生培养基中，然后置于24℃、连续光照且光照强度为8000Lx条件下培养3‑4天；(6)选择将含有下胚轴外植体的滤纸从再生培养基中转移到选择培养基中，然后置于24℃、连续光照且光照强度为8000Lx条件下培养，直至可分离的愈伤组织；(7)芽诱导和延长从下胚轴外植体中分离愈伤组织并置于含选择剂的芽诱导培养基上，然后置于24℃、光照强度为8000Lx、光照时间为16h/8h day/night条件下孵育愈伤组织，每2周将其转移至新鲜的芽诱导培养基上，培养4周后去除选择剂；当形成肉眼可见的芽时，将含有芽的愈伤组织转移到芽伸长培养基中进行培养，培养温度为24℃，光照强度为8000Lx，光照时间为16h/8h day/night；(8)根诱导和延长当单个芽长到1‑2cm时切下，移至含有根诱导培养基的培养皿中，置于24℃、连续光照且光照强度为8000Lx条件下培养一周，然后转移到根伸长培养基中进行培养，当根系发达后，将根置于培养了2天的根瘤菌菌液中浸泡5min，然后移栽到含有蛭石/砂混合物的栽培基质中进行炼苗，炼苗过程中温度为24℃，光照强度为5000Lx，光照时间为16h/8h day/night。