[发明专利]一种单层上皮细胞模型快速分类筛选新药血脑屏障通透性的方法

说明书

本发明涉及细胞模型技术领域，特别是涉及一种单层上皮细胞模型快速分类筛选新药血脑屏障通透性的方法。本发明利用野生型LLC‑PK1细胞和过表达MDR1的LLC‑PK1细胞构建得到两种单层细胞，并将两种单层细胞用于双向转运实验，通过整合两种单层细胞模型的双向转运实验结果，快速分类筛选预测药物的BBB通透性，可进行系列化合物BBB透膜特征的快速排序，并分析BBB透膜机制，特别适用于药物早期的快速筛选评价。

技术领域

本发明涉及细胞模型技术领域，特别是涉及一种单层上皮细胞模型快速分类筛选新药血脑屏障通透性的方法。

背景技术

血脑屏障(BBB)是内源物和药物分子进入脑实质的重要通道，由于BBB结构独特复杂，药物跨越BBB受到极大限制。评价化合物能否透过BBB进入脑组织是药物研发中的重要指标之一，因此多年来从事药物开发特别是中枢神经系统(CNS)药物研究的人员一直在不断构建和改良BBB模型。BBB是由脑毛细血管内皮细胞形成的血管壁，内皮细胞间有紧密连接蛋白(包括Occludin、Claudin、ZO-1等)形成了细胞间紧密连接，在内皮细胞上还表达有P-gp、BCRP等外排转运蛋白，阻止一些药物的进入，血管壁外周还有星形胶质细胞以及周细胞共同组成了致密的生物屏障。

为了筛选评价药物透过BBB的能力，细胞模型是重要的体外模型。目前常用的细胞模型包括动物和人源的原代血管内皮细胞培养的单层细胞、血管内皮细胞系培养的单层细胞以及与星形胶质细胞和周细胞共培养、以及多能干细胞诱导分化的血管内皮细胞的BBB模型，应用Transwell细胞培养板进行双向转运实验。近年来，还发展了3D微流控芯片共培养血管内皮细胞和星形胶质细胞等动态BBB模型以及微血管网络系统(MCNs)等模型。以上模型都存在一些明显的问题限制其广泛应用。首先，基于Transwell的脑血管内皮细胞单培养模型在实践应用中发现，脑血管内皮细胞在脱离了生理微环境在体外培养时，会迅速去分化并丧失原有特征，发生“表型漂移”，不能形成完整的血脑屏障结构并发挥功能；其次，将脑血管内皮细胞与星形胶质细胞和周细胞共培养后，由于增加了细胞间的相互作用，能够诱导内皮细胞分化出外排蛋白以及细胞连接蛋白，并且更接近生理状态，但是也有研究发现，该模型不仅费时费力，培养难度大，而且并没有明显提高BBB的功能，仍远远低于体内的致密度。因此，3D细胞培养模型通过建立“微血管管道”能够模拟体内中枢微血管系统。该模型利用生物性材料，制造出可以让液体流动通过的“血管”框架，将单层内皮细胞排列在管道内侧，并将周细胞或胶质细胞种植于“血管”外侧的芯片中，还可以加入生长因子。在3D体外细胞模型中，为了模拟血脑屏障的功能，I型胶原蛋白或基质胶是必须的。因此，基于3D微流控芯片的BBB模型虽然提高了体内相关性，但成本高、重复性差、难以批量应用，在普通实验室推广有明显难度。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种单层上皮细胞模型快速分类筛选新药血脑屏障通透性的方法。本发明提供的方法实验过程简单、通量高、重复性好，可快速分类预测化合物的血脑屏障透过特征，与体内脑组织分布有明显相关性，可在一般实验室推广应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种单层上皮细胞模型快速分类筛选新药血脑屏障通透性的方法，包括以下步骤：

将LLC-PK1细胞和LLC-PK1-MDR1细胞分别接种于Transwell板的小室上室，培养得到跨膜电阻值为70Ω·cm²的LLC-PK1细胞单层膜和跨膜电阻值为66Ω·cm²的LLC-PK1-MDR1细胞单层膜；

将所述LLC-PK1细胞单层膜和所述LLC-PK1-MDR1细胞单层膜分别进行待测药物的双向转运实验，其中Transwell板的小室上室加入待测药物，Transwell板的小室下室加入缓冲液，记为A-B转运方向；Transwell板的小室下室加入待测药物，Transwell板的小室上室加入缓冲液，记为B-A转运方向；