[发明专利]一种体外脂肪肝类器官模型及其制备方法与在药物测试中的应用

权利要求书

1.一种生物墨水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)DMEM完全培养基的制备：高糖DMEM培养基中添加抗生素、非必需氨基酸溶液、胰岛素、谷氨酰胺、氢化可的松琥珀酸酯和胎牛血清；

(2)水凝胶制备：将一定量的明胶粉末、海藻酸钠粉末置于紫外灯下照射后，溶解于DMEM完全培养基中，然后把悬浮液放到烘箱中，使海藻酸钠和明胶充分溶解，溶剂完成后高压蒸汽灭菌，放入培养箱中备用；

(3)细胞悬浮液制备：将HepaRG细胞置于DMEM完全培养基中，在细胞培养箱中培养，当HepaRG细胞在培养皿内增殖后，先用移液枪吸出培养皿中的原培养基，用PBS清洗，洗去残留的培养基，其次加入胰蛋白酶在培养箱内消化；待细胞漂浮时，加入DMEM完全培养基终止消化；接着，将胰蛋白酶与DMEM完全培养基混合均匀，轻轻吹打从而使细胞从皿底脱落；将混合液体移入离心管，在离心机中进行离心，弃去上清液；再加入层粘连蛋白溶液、纤维蛋白原溶液与DMEM完全培养基进行细胞重悬，得到细胞悬浮液；

(4)生物墨水制备：将步骤(3)获得的细胞悬浮液与水凝胶混合物混合，吹打，即得。

2.根据权利要求1所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中高糖DMEM培养基中添加1％(v/v)抗生素、1％(v/v)非必需氨基酸溶液、5μg/mL胰岛素、2mM谷氨酰胺、50μM氢化可的松琥珀酸酯和10％胎牛血清。

3.根据权利要求1所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中明胶的终浓度为5％(wt％)，海藻酸钠的终浓度为1％(wt％)。

4.根据权利要求1所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中细胞悬浮液与水凝胶混合物的体积比为1:1。

5.根据权利要求1所述的生物墨水的制备方法，其特征在于，该生物墨水中的明胶、海藻酸钠、纤维蛋白原、层粘连蛋白及其细胞的最终浓度为：5％(w/v)，1％(w/v)，1mg/ml、30μg/ml和1×10⁷cells/ml。

6.采用权利要求1-3任一项的制备方法制备的生物墨水。

7.采用权利要求1-3任一项的制备方法制备的生物墨水的应用。

8.一种体外脂肪肝类器官模型的制备方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求6的生物墨水加入一个带有针头的消毒注射器中，装载至打印机的针筒中，调整针筒温度，打印机形成室温度，以保持在打印过程中细胞活力达到条件；

(2)使用计算机软件设置打印轨迹，将培养皿放置在打印台，来收集打印出的结构；以层层堆叠的方式按照预设的打印轨迹制作一个立体网格结构；

(3)将步骤(2)获得的立体网格结构转移到CaCl₂溶液中浸没交联，然后生理盐水冲洗；再加入DMEM完全培养基培养，后转移至脂肪肝类器官诱导培养基中，置于细胞培养箱中培养，定期更换脂肪肝类器官诱导培养基；

(4)在将培养后的肝组织模型中添加DMSO进行诱导分化；完成诱导后，观察其结构，肝细胞呈类器官样结构，即得。

9.采用权利要求8的制备方法制备的体外脂肪肝类器官模型。

10.一种脂肪肝药物的体外测试方法，包括以下步骤：

(1)在如权利要求9的体外脂肪肝类器官模型中，加入脂肪肝药物，使用DMEM完全培养基培养脂肪肝类器官模型；

(2)然后转入Elafibanor预防培养基培养；

(3)评估脂肪肝类器官模型中的脂滴积累和白蛋白分泌情况。