[发明专利]昆虫RPA-LFD检测引物和探针以及检测方法

权利要求书

1.昆虫RPA-LFD检测引物和探针，其特征在于，所述的昆虫RPA-LFD检测引物选自以下第(1)组或第(2)组中的任何一组检测引物：

第(1)组检测引物：所述的检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；

第(2)组检测引物：所述的检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；

所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的昆虫RPA-LFD检测引物和探针，其特征在于，在所述检测引物的下游引物的5’端连接有生物素；

在探针的5’端连接有荧光基团；在探针的3’端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，优选的，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团是C3-Spacer；将距探针的3’端的第15个碱基胞嘧啶用四氢呋喃替换。

3.权利要求1或2所述的昆虫RPA-LFD检测引物和探针在检测苹小吉丁中的应用；优选的，所述昆虫是苹小吉丁。

4.昆虫RPA-LFD检测试剂盒，包括：冻干酶，复水缓冲液，昆虫RPA-LFD检测引物和探针，ddH₂O，醋酸镁和胶体金试纸条；其特征在于，所述的昆虫RPA-LFD检测引物选自以下第(1)组或第(2)组中的任何一组检测引物：

第(1)组检测引物：所述的检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；

第(2)组检测引物：所述的检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；

所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

5.根据权利要求4所述的昆虫RPA-LFD检测试剂盒，其特征在于，在所述检测引物的下游引物的5’端连接有生物素；

在探针的5’端连接有荧光基团；在探针的3’端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，优选的，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团是C3-Spacer；将距探针的3’端的第15个碱基胞嘧啶用四氢呋喃替换。

6.根据权利要求4所述的昆虫RPA-LFD检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金试纸条在结合垫上预埋抗荧光素抗体，该抗荧光素抗体与胶体金相连；在检测线上预埋链霉亲和素；在质控线上预埋二抗，该二抗与抗荧光素抗体特异性结合。

7.权利要求4-6任何一项所述的昆虫RPA-LFD检测试剂盒在检测苹小吉丁中的应用；优选的，所述昆虫是苹小吉丁。

8.一种苹小吉丁的RPA-LFD检测方法，其特征在于，包括：

(1)提取待检测样品的DNA；(2)以待检测样品的DNA为模板，以权利要求1或2所述苹小吉丁RPA-LFD检测上、下引物和探针建立重组酶聚合酶扩增体系并进行扩增反应；(3)将扩增反应的产物用ddH₂O稀释，将稀释后的扩增产物添加到胶体金试纸条的样品孔；当检测线与质控线均显示红色时，表明待检测样品中含有苹小吉丁；当检测线不显示红色，质控线显示红色时，表明待检测样品中不含有苹小吉丁；当质控线不显示红色时为无效检测结果。

9.根据权利要求8所述的苹小吉丁的RPA-LFD检测方法，其特征在于，步骤(2)中所建立的重组酶聚合酶扩增体系包括：苹小吉丁RPA-LFD检测上、下游引物各2.0μL，探针0.6μL，待检测的样品DNA模板2.0μL，ddH₂O 11.5μL；以上混合均匀后，加入2.5μL的醋酸镁启动反应。

10.根据权利要求8所述的苹小吉丁的RPA-LFD检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的扩增反应包括38℃条件下反应10min。