[发明专利]一种欧洲海鲈NPFFR2重组质粒、细胞系及其应用

说明书

本发明属于海洋生物领域，具体涉及一种欧洲海鲈NPFFR2重组质粒、细胞系及其应用。所述欧洲海鲈NPFFR2重组质粒含有欧洲海鲈NPFFR2‑1基因和NPFFR2‑2基因；本发明首次扩增编码欧洲海鲈NPFFR2‑1和NPFFR2‑2蛋白的基因，并将该基因构建重组质粒，利用细胞转染和双萤光素酶报告系统可以用于研究NPFF的信号转导机制以及与其他神经内分泌因子之间的信号互作机制。

技术领域

本发明属于海洋生物领域，具体涉及一种欧洲海鲈NPFFR2重组质粒、细胞系及其应用。

背景技术

欧洲海鲈（ Dicentrarchuslabrax），或称欧洲舌齿鲈，是舌齿鲈属下的一种鱼类，在淡水和咸水中都可以存活，其生长速度快，抗病能力强，肉质鲜美，是欧洲重要的经济鱼类之一，广泛分布于大西洋东部、地中海和黑海以及欧洲的湖泊河流中。

NPFF是RFa家族成员之一，与GnIH起源于同一祖先基因，能够调节脊椎动物的摄食过程。欧洲海鲈 npff基因编码NPFF和NPAF两种成熟肽， gnih基因编码GnIH1和GnIH2两种成熟肽，但这些神经肽在鱼类摄食调控中的作用及其分子机制尚不清楚。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种欧洲海鲈NPFFR2重组质粒，该重组质粒的建立能够为阐明鱼类NPFF作用机制提供技术支撑。

本发明的另一目的是提供了上述欧洲海鲈NPFFR2重组质粒与其他神经内分泌因子之间信号互作的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种欧洲海鲈NPFFR2重组质粒，含有欧洲海鲈NPFFR2-1基因和NPFFR2-2基因；

所述NPFFR2-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述NPFFR2-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步的，所述NPFFR2-1的蛋白基因序列如SEQ ID NO：3所示；所述NPFFR2-2蛋白基因序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明构建的重组质粒的表达载体为pcDNA3.1；并且上下游两端含有Hind III和EcoRI的酶切位点，构建成含有编码欧洲海鲈NPFFR2-1和NPFFR2-2蛋白的表达载体pcDNA3.1-NPFFR2-1和pcDNA3.1-NPFFR2-2。

本发明构建重组质粒过程中，所述NPFFR2-1的引物序列为：

5’- CCCAAGCTTATGACACAGAATACGGTT-3’（SEQ ID NO：5）

5’- CGGAATTCCTAAATCTGGGATACCTT-3’（SEQ ID NO：6）

所述NPFFR2-2的引物序列为：

5’- CCCAAGCTTATGAACGAAGGACTTGAA-3’ （SEQ ID NO：7）

5’- CGGAATTCTCAAATAGACACTGCTGT-3’ （SEQ ID NO：8）。

本发明还提供了一种表达上述重组质粒的细胞系，将表达载体pcDNA3.1-NPFFR2-1和pcDNA3.1-NPFFR2-2转入COS-7中所形成的表达NPFFR2-1和NPFFR2-2蛋白的细胞系，pcDNA3.1-NPFFR2-1-COS-7和pcDNA3.1-NPFFR2-2-COS-7。

本发明还提供了一种上述细胞系在检测NPFFR2下游信号通路中的应用，包括以下步骤：