[发明专利]一种欧洲海鲈NPFFR2重组质粒、细胞系及其应用

权利要求书

1.一种欧洲海鲈NPFFR2重组质粒，其特征在于，含有欧洲海鲈NPFFR2-1基因和NPFFR2-2基因；

所述NPFFR2-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述NPFFR2-2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的欧洲海鲈NPFFR2重组质粒，其特征在于，所述NPFFR2-1的蛋白基因序列如SEQ ID NO：3所示；所述NPFFR2-2蛋白基因序列如SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求1或2所述的欧洲海鲈NPFFR2重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达载体为pcDNA3.1；并且上下游两端含有Hind III和EcoRI的酶切位点，构建成含有编码欧洲海鲈NPFFR2-1和NPFFR2-2蛋白的表达载体pcDNA3.1-NPFFR2-1和pcDNA3.1-NPFFR2-2。

4.根据权利要求3所述的欧洲海鲈NPFFR2重组质粒，其特征在于，所述NPFFR2-1的引物序列为：

5’- CCCAAGCTTATGACACAGAATACGGTT-3’，如SEQ ID NO：5所示

5’- CGGAATTCCTAAATCTGGGATACCTT-3’， 如SEQ ID NO：6所示

所述NPFFR2-2的引物序列为：

5’- CCCAAGCTTATGAACGAAGGACTTGAA-3’ ，如SEQ ID NO：7所示

5’- CGGAATTCTCAAATAGACACTGCTGT-3’ ，如SEQ ID NO：8所示。

5.一种表达权利要求4所述的重组质粒的细胞系，其特征在于，将表达载体pcDNA3.1-NPFFR2-1和pcDNA3.1-NPFFR2-2转入COS-7中所形成的表达NPFFR2-1和NPFFR2-2蛋白的细胞系，pcDNA3.1-NPFFR2-1-COS-7和pcDNA3.1-NPFFR2-2-COS-7。

6.一种权利要求5所述的细胞系在检测NPFFR2下游信号通路中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将细胞系接种在DMEM液体培养基中，37℃，5%CO2条件下培养过夜，吸掉旧的培养基后用PBS清洗细胞一次，按照每孔200 ng pcDNA3.1-NPFFR2-1/pcDNA3.1-NPFFR2-2、200 ngCRE-luc和20 ng pRL-TK的量进行细胞转染，随后继续37℃ 5%CO2条件下培养过夜；

（2）吸掉旧的培养基后用含有GnIH1、GnIH2、NPFF和NPAF的多肽处理COS-7细胞6 h，然后用裂解液破碎细胞，收集上清，分别检测萤火虫萤光素酶活性和海参萤光素酶活性，进而分析NPFFR2-1和NPFFR2-2下游信号通路。

7.一种如权利要求1-4任一项所述的重组质粒在用于分析同其他神经内分泌因子之间的信号互作机制中的应用。