[发明专利]一种检测外泌体miRNA21的荧光传感器及其制备与应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种检测外泌体miRNA21的荧光传感器及其制备与应用，所述传感器包括外泌体miRNA21、信号识别部分和信号转换部分，信号识别部分包括捕获探针，捕获探针上含有一段被封闭的引物序列，外泌体miRNA21与捕获探针结合使引物暴露；信号转换部分为：引物与发夹A结合触发级联引物交换反应，生成产物，产物与硫黄素ThT结合产生荧光，实现外泌体miRNA21的检测。本发明首次将级联PER反应用于检测外泌体miRNA21，通过PER的信号放大作用结合，使荧光信号进一步放大，提高灵敏度和特异性；无需洗涤，能一步法实现检测，操作简便；利用捕获探针识别miRNA21，捕获探针可通过程序设计，无需复杂的DNA抗体偶联，且捕获探针空间位阻较小可有效识别外泌体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测外泌体miRNA21的荧光传感器及其制备与应用。

背景技术

miRNA是一种约22个核苷酸的非编码小分子RNA，可以通过介导信使RNA的翻译来促进如乳腺癌、肺癌等肿瘤的发生和发展。与外周血中的miRNA相比，外泌体miRNA由于被外泌体膜保护而在循环中显示出高稳定性，并占外泌体总RNA的76.20％。因此，外泌体miRNA被认为是可靠的肿瘤生物标志物，在癌症无创诊断中具有很大的检测价值。然而，早期肿瘤来源的外泌体miRNA丰度较低，因此准确检测外泌体miRNA仍然是临床检验中面临的一大难题。外泌体是30-150nm的盘状膜囊泡，几乎分泌于所有细胞。研究表明，外泌体通过其内容物(包括核酸，蛋白质和脂质体)的细胞间转移而密切参与各种病理过程，其中外泌体miRNA在这一过程中起到重要作用。

定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)是检测外泌体miRNA的主要方法。然而，由于昂贵的实验设备，大型实验室规模和复杂的操作程序等需求，qRT-PCR的可用性受到了极大的限制。因此，开发一种具有高特异性和灵敏性的新传感策略以检测外泌体miRNA具有重要的临床意义。

如何实现外泌体miRNA的高灵敏、免标记、经济高效检测？外泌体miRNA作为液体活检的生物标志物具有独特的优势，其检测在肿瘤的早期筛查和精准医疗中蕴含巨大的潜力和价值，但目前检测miRNA的传统方式存在一定弊端。因此实现外泌体miRNA高灵敏，免标记，经济高效的方法具有重要的临床意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测外泌体miRNA21的荧光传感器及其制备与应用，本发明创新地提出了一种单步无标记的外泌体miRNA21荧光成像的生物传感策略，通过捕获探针(Capture)激活引物交换反应，结合荧光分子后产生放大且可靠的荧光，从而实现肿瘤细胞来源的外泌体miRNA21的原位检测。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种检测外泌体miRNA21的荧光传感器，包括外泌体miRNA21、信号识别部分和信号转换部分，所述信号识别部分包括能与外泌体miRNA21结合的捕获探针，所述捕获探针上含有一段被封闭的引物序列，外泌体miRNA21与捕获探针结合，使引物暴露；所述信号转换部分为：所述引物与发夹结合触发级联引物交换反应(Primer Exchange Reaction，PER)，生成产物，所述产物与硫黄素ThT结合产生荧光，实现外泌体miRNA21的检测。

进一步，所述捕获探针的核苷酸序列为：

5′-GCCTCTACTCAACATCAGTCTGATAAGCTAGATGTTGAGTAG-3′(SEQ ID NO.1)。

进一步，所述捕获探针包含的引物选自引物1或引物2中的至少一种，所述引物1的核苷酸序列为：5′-CTACTCAACTACTCAAAGTTGAGTAGGAA-3′(SEQ ID NO.2)，所述引物2的核苷酸序列为：5′-TTCCTACTTTCCTACTAAAGTAGGAAGGT-3′(SEQ ID NO.3)。

进一步，所述发夹选自发夹A、发夹B、发夹C与发夹D中的至少一种；所述发夹A的核苷酸序列为：