[发明专利]一种SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统缺失模型的方法

说明书

本发明涉及基因干扰技术领域，具体公开了一种SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统缺失模型的方法，包括以下步骤：步骤一：扩增SIX1基因，作为dsRNA体外合成的模板；步骤二：dsRNA体外合成与纯化；步骤三：干扰涡虫，完成涡虫视神经系统(眼点)缺失模型构建。本发明构建的涡虫视神经系统(眼点)缺失模型为筛选独立于脑部缺陷的视神经系统(眼点)调控基因的研究奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因干扰技术领域，尤其是涉及一种SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统缺失模型的方法。

背景技术

日本三角涡虫(Dugesia japonica)，隶属扁形动物门，涡虫纲，三肠目，一般生活在温度较低、水流缓慢的溪流中。日本三角涡虫身体似扁平叶状，呈淡褐色，背面着色较深，头部呈三角形，故因此而得名。涡虫具有脑、眼、神经、肌肉、肠、肾、卵巢、睾丸等器官，是三胚层生物中唯一能完全再生的模式生物。涡虫作为一种简单的后生动物，又兼具体型小、饲养条件简单、实验操作简便等特点，已经成为研究再生的理想生物模型。

涡虫是具有明确的双边对称性、背腹极性、中枢神经系统(CNS)和简单的大脑结构的早期生物群。涡虫中枢神经系统位于身体的腹侧，由三部分结构组成：前脑、光感受器(眼点)和腹神经索。涡虫眼点位于头部神经节的背侧，由两种细胞类型组成：杯状色素细胞和光敏神经元组成。尽管涡虫眼点结构比人眼简单得多，但仍有许多相似之处，涡虫的眼点表达许多与脊椎动物感光细胞和视网膜色素上皮细胞同源的基因，因此可用涡虫作为研究眼睛再生的模型，为人类视觉功能恢复提供新的思路。

视神经系统是中枢神经系统的组成部分，其内在或自发再生能力受其他CNS组织再生影响因素的限制，因此独立于其他CNS组织损伤研究视神经系统再生机制是十分必要的。然而现有研究一般是将涡虫头尾切割后靶向目的基因进行RNA干扰，观察涡虫脑部及眼点再生情况，但脑畸形会导致涡虫眼点出现继发性缺陷，不能说明目的基因对涡虫眼点发育具有直接的调控作用。因此，通过SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统(眼点)缺失模型具有较好的适用性，为筛选独立于脑部缺陷的视神经系统(眼点)调控基因的研究奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统(眼点)缺失模型的方法及应用，以解决上述背景技术中提出的眼点缺陷可能继发于脑畸形的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统(眼点)缺失模型的方法及应用，包括以下步骤：

步骤一：扩增SIX1基因，作为dsRNA体外合成的模板。从现存的涡虫转录组测序结果中获得SIX1基因的cDNA序列。利用Primer Primer5软件进行引物设计，随后，配置SIX1扩增体系，均匀混合后放入PCR仪中，程序结束后，将PCR扩增产物进行DNA凝胶电泳点样并胶回收纯化PCR产物；将纯化产物与pMD 19-T载体4℃连接过夜，然后转化感受态DH5α细胞；37℃培养箱培养10-12h，挑取10个单克隆菌落摇菌和菌落PCR鉴定。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取PCR产物大小和目的基因大小相对应的样品，送生物公司测序，剩余菌液保存于4℃；待测序结果返回后，使用SnapGene软件进行测序结果比对，将测序结果正确的菌液扩大培养。需要扩大培养的菌液接种到30mL氨苄抗性LB培养基中，放入恒温震荡培养箱，37℃过夜培养；待菌液浑浊时，取700μL菌液保种，剩余菌液用于提取质粒。

步骤二：dsRNA体外合成与纯化。从质粒上扩增带有T7启动子序列的目的基因，PCR程序结束后，胶回收PCR产物；配置dsRNA体外合成体系于37℃金属浴过夜孵育，第二天利用乙酸铵纯化dsRNA。

步骤三：干扰涡虫，完成涡虫视神经系统(眼点)缺失模型构建。选取饥饿7天、体长相近的涡虫进行头尾切割，浸泡在含有一定浓度dsRNA的水中，每天换水，第7天检测干扰效果及涡虫眼点发育情况。