[发明专利]一种SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统缺失模型的方法

权利要求书

1.一种SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统缺失模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：扩增SIX1基因，作为dsRNA体外合成的模板。从现存的涡虫转录组测序结果中获得SIX1基因的cDNA序列。利用Primer Primer5软件进行引物设计，随后，配置SIX1扩增体系，均匀混合后放入PCR仪中，程序结束后，将PCR扩增产物进行DNA凝胶电泳点样并胶回收以纯化PCR产物；将纯化产物与pMD 19-T载体4℃连接过夜，然后转化感受态DH5α细胞；37℃培养箱培养10-12h，挑取10个单克隆菌落摇菌和菌落PCR鉴定。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取PCR产物大小和目的基因大小相对应的样品，送生物公司测序，剩余菌液保存于4℃；待测序结果返回后，使用SnapGene软件进行测序结果比对，将测序结果正确的菌液扩大培养。需要扩大培养的菌液接种到30mL氨苄抗性LB培养基中，放入恒温震荡培养箱，37℃过夜培养；待菌液浑浊时，取700μL菌液保种，剩余菌液用于提取质粒。

步骤二：dsRNA体外合成与纯化。从质粒上扩增带有T7启动子序列的目的基因，PCR程序结束后，胶回收PCR产物；配置dsRNA体外合成体系于37℃金属浴过夜孵育，第二天利用乙酸铵纯化dsRNA。

步骤三：干扰涡虫，完成涡虫视神经系统(眼点)缺失模型构建。选取饥饿7天、体长相近的涡虫进行头尾切割，浸泡在含有一定浓度dsRNA的水中，每天换水，第7天检测干扰效果及涡虫眼点发育情况。

2.根据权利要求1所述的SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统缺失模型的方法，其特征在于步骤一中，所述SIX1基因的引物序列前加上T7启动子序列：TAATACGACTCACTATAGG。

3.根据权利要求1所述的SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统缺失模型的方法，其特征在于步骤二中，胶回收PCR扩增产物时，用DEPC水洗脱，作为SIX1-dsRNA体外合成的模板。

4.根据权利要求3所述的SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统缺失模型的方法，其特征在于体外合成dsRNA，为确保双链RNA正确配对，需要进行变性与退火：95℃变性3min，75℃孵育3min，50℃孵育3min，室温静置5min即可。

5.根据权利要求1所述的SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统缺失模型的方法，其特征在于步骤三中，从实验室已有的pEGFP-N1质粒上扩增涡虫不表达的EGFP基因，作为对照检测SIX1-dsRNA处理后的干扰效果及涡虫眼点发育情况。

6.根据权利要求5所述的SIX1基因干扰构建涡虫视神经系统缺失模型的方法，其特征在于检测干扰效果及涡虫眼点发育情况的具体方法为：分别提取实验组和对照组的RNA，并进行反转录，以此cDNA为模板进行RT-qPCR分析SIX1基因表达变化；体式显微镜观察涡虫眼点发育情况。