[发明专利]一种门冬胰岛素的制备方法

说明书

本发明涉及一种门冬胰岛素的制备方法，特别是一种门冬胰岛素前体的纯化方法及门冬胰岛素的制备方法。本发明充分利用Lys‑C酶特点，设计专门适用Lys‑C酶酶切的重组构建体和门冬胰岛素制备工艺。本发明的制备工艺简化、且使用Lys‑C酶，在保证较高酶切效率的同时，显著降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种门冬胰岛素的制备方法，特别是一种门冬胰岛素前体的纯化方法及门冬胰岛素的制备方法。

背景技术

糖尿病是一种由于机体胰岛素分泌不足或利用缺陷而导致的慢性疾病，胰岛素是由胰脏胰岛β细胞受到内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、胰高血糖素等的刺激所分泌的蛋白质激素，能够使血液中的葡萄糖进入细胞并转化为机体活动所需的能量。人胰岛素由α、β两个前体组成其中，α链有11种21个氨基酸，β链有15种30个氨基酸。糖尿病患者体内胰岛素的缺乏或作用缺陷使体内的葡萄糖持续存留在循环血液中，而这种高血糖可能会引起如糖尿病酮症酸中毒、高糖高渗性昏迷、乳酸性酸中毒等急性并发症，心血管疾病、肾病等慢性并发症，致残致死率高。

胰岛素治疗是控制高血糖的重要手段，按照种类不同，胰岛素分为动物胰岛素、重组人胰岛素和胰岛素类似物三代产品。其中，上世纪70年代通过基因工程开发出的重组人胰岛素具有免疫原性低、长期使用安全可靠、效价比高等优点，在临床中应用最为广泛。到了90年代，随着胰岛素生产技术的不断发展，人们又相继开发出了具有不同作用时间特点的胰岛素类似物，例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、德谷胰岛素等。

门冬胰岛素(美国专利US5618913，US5547930，US5834422)是一种快速作用的胰岛素类似物，由丹麦诺和诺德公司研制开发。与人胰岛素不同之处在于，将人胰岛素氨基酸链B28位的脯氨酸用带负电荷的门冬氨酸取代，增强了电荷排斥，从而能够阻止六聚体形成。因此，与正常的人胰岛素相比，门冬胰岛素的作用更迅速，效力持续时间更短。此外，门冬胰岛素与血浆蛋白的结合程度较低，它比普通人胰岛素能够更快的从血液中清除(NosekL等人，Diabetes，ObesityandMetabolism，15：77-83，2013；和SanliogluAD等人，Clinicalutility of insulin and insulin analogs.Islets5(2)：67-78，2013.)。同时门冬胰岛素制剂的药代动力学接近人胰岛素的生理分泌曲线，且与常规人胰岛素相比，其药代动力学特性是常规人胰岛素的一半左右，起效时间为10-20分钟，达到峰值时间为40分钟，作用持续时间3-5小时，既有效控制了血糖，也不会造成夜间严重的低血糖事件。

目前，门冬胰岛素的制备一般采用基因工程技术制备前体，原研公司诺和诺德以酿酒酵母为表达宿主，利用重组DNA技术生产得到门冬胰岛素前体，再通过转肽等一系列复杂工艺制备门冬胰岛素。该方法在宿主菌改造等方面技术难度大、工艺复杂。由于酿酒酵母自身表达能力较弱，因此门冬胰岛素产量不高，其工程菌摇床培养最高为21.5mg/L，一定程度上增加了药品生产成本。相比酿酒酵母，毕赤酵母操作简单、易于培养、生长速度快、外源蛋白表达量高、AOX强效启动子将甲醇作为唯一碳源进行高密度发酵，受甲醇严格调控，是目前最强、调控机制最严格的启动子之一，可控制外源蛋白大量表达并以分泌形式释放到胞外，产物后期处理同样简单。与酿酒酵母相比，该系统外源蛋白表达量更高、糖基化程度低，表达产物不会出现过度糖基化现象。因此毕赤酵母是目前最为理想的真核表达系统之一。但目前现有的纯化方法的酶切效率较低，且纯化困难和收率较低。

因此，提供一种回收效率高、产品纯度高的门冬胰岛素的前体纯化及制备工艺显得尤为重要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种门冬胰岛素的制备方法。