[发明专利]一种门冬胰岛素的制备方法

权利要求书

1.一种门冬胰岛素前体的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括如下步骤：

(1)收集包含门冬胰岛素前体融合蛋白的发酵液，所述门冬胰岛素前体融合蛋白的氨基酸结构如下所示：

Leader-FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDK-Linker-GIVEQCCTSICSLYQLENYCN；

其中，

Leader为C末端为K的引导肽；

Linker为C末端为K的连接肽，分别与门冬胰岛素B链的C末端和门冬胰岛素A链的N末端相连；

(2)发酵液经过层析纯化处理、酶切、反相层析纯化处理、等电点沉淀，得到所述门冬胰岛素前体，所述酶切使用Lys-C酶；

其中，所述层析纯化处理的方法为：将发酵液离心收集上清液，上清液进行阳离子交换层析纯化处理，并收集洗脱溶液；

所述酶切的方法为：将洗脱溶液调节pH至7.5-8.0，按照Lys-C酶:门冬胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(10000-10500)的比例添加Lys-C酶，进行酶切反应，得到酶切反应溶液；

所述反相层析纯化处理的方法为：酶切反应溶液利用C8硅胶树脂进行反相层析纯化处理，得到反相层析溶液；

所述等电点沉淀的方法为：将反相层析溶液进行稀释，并调节pH至5.3-5.7，离心收集沉淀。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在所述层析纯化处理中，使用的层析介质为键合磺酸基丙基的交联琼脂糖；使用的平衡液为pH为3.0-4.0的乙酸钠溶液；使用的洗脱溶液为三羟甲基氨基甲烷溶液；层析柱介质载量为60-65g/L。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述酶切的方法为：将洗脱溶液调节温度为33-36℃，利用三羟甲基氨基甲烷溶液稀释至浓度为4.5-8.5g/L，调节pH至7.5-8.0，按照Lys-C酶:门冬胰岛素前体融合蛋白的质量比为1:(10000-10500)的比例添加Lys-C酶，进行酶切反应40-50h，得到酶切反应溶液。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在所述反相层析纯化处理中，层析柱介质载量为25-30g/L，控制流速不高于420cm/h，使用的层析溶液以硫酸铵-三羟甲基氨基甲烷溶液为A相，乙腈-三羟甲基氨基甲烷溶液为B相，使用的平衡液为5％的B相。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述等电点沉淀的方法为：将反相层析溶液稀释2-3倍，并调节pH至5.3-5.7，离心收集沉淀，按照1g样品湿重:(8-12)mL纯化水的比例添加纯化水洗涤，离心收集沉淀，重复洗涤一次后，按照1g样品湿重:(8-12)mL纯化水的比例添加纯化水匀浆，冻干。

6.一种门冬胰岛素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将权利要求1-5中任一项所述的纯化方法制备得到的门冬胰岛素前体利用修饰剂和Lys-C酶进行转肽反应，反应结束后经过反相层析I、沉淀分离、脱保护，得到含有门冬胰岛素粗品的过滤液，所述修饰剂为[H-Thr(tBu)-OtBu·AcOH]；

所述含有门冬胰岛素粗品的过滤液经反相层析II、结晶，得到门冬胰岛素纯品。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述转肽反应的方法为：将门冬胰岛素前体溶解在转肽反应液中，按照门冬胰岛素前体:修饰剂的质量比为1:(2.5-3)的比例添加修饰剂，按照Lys-C酶:门冬胰岛素前体的质量比为1:(1400-1500)的比例添加Lys-C酶，进行反应，反应结束后，稀释产物溶液并调节pH至5.4-5.6，离心收集沉淀，盐酸复溶，并加入乙腈和乙二胺四乙酸二钠，调节pH至8.0-8.5，得到产物稀释液，所述转肽反应液为二甲基亚砜、三羟甲基氨基甲烷和1,4-丁二醇的混合液。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述反相层析I的方法为：产物稀释液利用C8硅胶树脂进行反相层析I纯化处理，得到反相层析I溶液。