[发明专利]甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明利用蛋白分离纯化技术从柞蚕中分离纯化获得天然甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物，解析其一级结构(基因和蛋白质)后利用基因工程技术实现甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其衍生物或类似物或部分片段基因在宿主细胞的表达，纯化获得重组甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其衍生物或类似物或部分片段，免疫动物，获得相应的抗体。本发明的天然、重组甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物以及其衍生物或类似物或部分片段以及其抗体可广泛应用于针对微生物的预防、检测、治疗药物等领域。

技术领域：

本发明属于生物医药技术领域，涉及甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物的结构及其获得方法与应用，具体地说，本发明涉及甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其衍生物、类似物、活性片段的结构及其制备方法，以及其在微生物及其相关分子模式检测、诱导昆虫酚氧化酶原激活系统、制备甘露聚糖结合型丝氨酸蛋白酶同系物及其衍生物、类似物、活性片段抗体等方面的应用。

背景技术：

先天性免疫系统是昆虫抵御外源病原体入侵最有效且唯一的防御机制，是生态系统中的重要一环。丝氨酸蛋白酶级联途径中蛋白酶在识别异常组织或微生物后通过特定的分子相互作用和蛋白水解被依次激活，形成初始信号的快速、局部的放大反应，从而发挥免疫效应。丝氨酸蛋白酶羧基末端的催化结构域的活性位点往往由组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸残基组成，即“催化三联体”。当该催化三联体结构发生氨基酸突变或直接缺失，这类丝氨酸蛋白酶便失去了催化活性，称为丝氨酸蛋白酶同系物(Serine protease homolog，SPH)。

丝氨酸蛋白酶及其同系物通过参与酚氧化酶原激活系统和Toll通路的级联反应，在节肢动物的先天免疫中发挥作用。在烟草天蛾中，宿主PRRs识别入侵病原体后，丝氨酸蛋白酶HP14、HP21、proHP1、HP6、HP8、PAP1-3和非催化丝氨酸蛋白酶同系物(SPH1和SPH2)可以构成细胞外SP-SPH系统介导黑色素形成和其他免疫反应。在黄粉虫中，丝氨酸蛋白酶级联放大系统可同时激活Toll途径及PPO，该系统包括可被顺序激活的三种不同丝氨酸蛋白酶。只有特定的SPH存在才能在黄粉虫中适当地激活酚氧化酶原，触发黑色素合成。黄粉虫SPH1这种高特异性的非催化调节蛋白对于调节黑色素的产生不可缺少。2010年Zhao等(Zhao P,Wang G,Dong Z,et al.Genome-wide identification and expression analysis ofserine proteases and homologs in the silkworm Bombyx mori[J].BMC Genomics,2010,11(1):405.)将家蚕核型多角体病毒、白僵菌、孟买芽孢杆菌和E.coli的混合菌液以喂食方式侵染家蚕幼虫，诱导后18个SP或SPH基因表达显著上调，说明SP和SPH基因可能参与了家蚕对病原微生物的抵抗。2011年Sakamoto等人(Sakamoto M,Ohta M,Suzuki A,etal.Localization of the serine protease homolog BmSPH-1in nodules of E.coli-injected Bombyx mori larvae and functional analysis of its role in nodulemelanization[J].Developmental and Comparative Immunology,2011,35(5):611-619.)的研究表明家蚕SPH1和SPH2可能与脂多糖结合蛋白BmLBP一起结合到大肠杆菌表面从血淋巴进入结节，是结节黑化的重要调节因子。2018年Lee等人(Lee K S,Kim B Y,Choo Y M,etal.Dual role of the serine protease homolog BmSPH-1in the development andimmunity of the silkworm Bombyx mori[J].Developmental and ComparativeImmunology,2018,85:170-176.)进一步研究发现家蚕SPH-1可以与家蚕免疫球蛋白(B.mori immulectin，BmIML)、BmPPAE和BmPPO形成PPO激活复合物，在感染期间定位于血细胞，促进免疫反应中结节的形成。2021年Yang等(Yang H,Ji T,Xiong H,et al.A trypsin-like serine protease domain of masquerade gene in crayfish Procambarusclarkii could activate prophenoloxidase and inhibit bacterial growth[J].Developmental and Comparative Immunology,2021,117:103980.)人证实克氏原螯虾中的丝氨酸蛋白酶同系物Mas可通过与细菌结合激活酚氧化酶原激活系统，从而参与甲壳类动物的先天性免疫防御。