[发明专利]一种表达几丁质酶的重组菌的构建及高酶活突变体的制备

说明书

本发明公开了一种表达几丁质酶的重组菌的构建及高酶活突变体的制备，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明使用内源性强启动子SpoVG及信号肽YqxI实现了地衣芽孢杆菌来源的几丁质酶BlChiA在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WS9中的分泌表达，并进一步定点突变，提高了几丁质酶的表达量与耐酸性。所得几丁质酶突变体E336K/A472T的发酵酶活达2.67U/mL，同时，该几丁质酶突变体最适反应pH为5.0，且在pH 3.0‑pH 6.0范围内有较好的稳定性，残余酶活达90％以上，具有稳定性好、酸耐受度强等优势，适用于工业化生产中获得高转化率的寡糖产物。

技术领域

本发明涉及一种表达几丁质酶的重组菌的构建及高酶活突变体的制备，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

几丁质又称甲壳素、甲壳质、甲壳胺等，是N-乙酰-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的直链多糖，脱乙酰化程度在40％以上时可转化为壳聚糖，是海洋中含量最丰富、自然界中含量仅次于纤维素的第二大可再生资源。几丁质及其类似物的降解产物氨基寡糖具备优越的生理功能和生物活性，在农业、医药和食品等领域有广泛的应用。

几丁质酶(EC 3.2.1.14)是一类水解几丁质β-1,4-糖苷键生成几丁寡糖或单糖的糖基水解酶，大多数几丁质酶属于糖基水解酶18家族和19家族，还有少数分布在20、23和48家族。几丁质酶在几丁质的降解中应用广泛，由于几丁质只溶于强无机酸，因此，几丁质的降解过程中需要一种耐酸性强的几丁质酶，但是天然的几丁质酶表达量低、酶活力差、耐酸性差，普遍通过多种几丁质酶协同作用降解几丁质，限制了几丁质酶的生产和应用。重组表达获得高效表达的耐酸性强的几丁质酶是高效利用几丁质资源的良好途径。

在真菌表达系统重组表达的几丁质酶存在对真菌细胞壁降解的可能，进而影响宿主菌的生长，导致几丁质酶的产量偏低；在原核表达系统中，枯草芽孢杆菌具有非致病性的特点，安全性高，同时培养周期短，对于工业生产缩短发酵周期也具有重要意义，是一种目前食品、药品、畜牧等行业生产各种工业用酶的理想表达宿主，但是目前在枯草芽孢杆菌中重组表达几丁质酶的报道较少，且酶活低、耐酸性差，限制了其工业应用。薛家威等将杀鱼假交替单胞菌C923几丁质酶基因PpchiC在大肠杆菌BL 21中克隆表达，该酶对几丁质有较好的降解效果但可溶性表达量极少，重组蛋白主要以包涵体的形式存在；在pH为8.0时表现最高酶活力，当pH为3.5时，酶活性下降至最高酶活的10％。尹义旭等将棘孢木霉TD3104来源的几丁质酶基因gene02524在毕赤酵母中异源表达，对部分病原菌生长有一定的抑制作用；该酶重组表达的酶活较低，诱导表达5天后酶活约为0.15U/mL，在pH3.0的环境中活性下降至最高酶活的20％。针对上述现有技术中重组几丁质酶表达酶活低、耐酸性差的问题，寻找一种高表达酶活、高耐酸性且性质稳定的几丁质酶对于高效利用几丁质资源具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种18家族的几丁质酶BlChiA突变体，该突变体是将Bacilluslicheniformis来源的几丁质酶BlChiA经定点突变获得的。与野生型几丁质酶BlChiA相比，突变体对酸性条件有更好的耐受性和广泛的pH稳定性，在几丁质酶的工业生产上有广阔前景。

本发明提供了提高几丁质酶表达量的突变体，包含如下任一种突变：

将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的几丁质酶的第336位的谷氨酸残基突变为赖氨酸残基，并命名为E336K；

将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的几丁质酶的第472位的丙氨酸残基突变为苏氨酸残基，并命名为A472T；

将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的几丁质酶的第336位的谷氨酸突变为赖氨酸，第472位的丙氨酸突变为苏氨酸，命名为E336K/A472T。