[发明专利]一种组织专一性VEGF表达下调载体的构建方法

说明书

本发明公开了一种组织专一性VEGF表达下调载体的构建方法，涉及基因工程技术领域。所述构建方法包括将组织专一性启动子和四环素调控转录沉默子依次插入至表达载体中的步骤。为实现对VEGF基因组织专一性的表达下调及功能研究，本发明借助组织特异性启动子，构建VEGF基因表达下调载体。将视网膜专一性启动子HB序列和四环素调控转录沉默子tetR‑Krab序列依次插入到哺乳动物细胞表达载体pCAGGS中，构建专一性下调视网膜VEGF基因表达的转录沉默子表达载体，以实现组织专一性VEGF基因表达调节，为深入探究VEGF基因功能提供基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种组织专一性VEGF表达下调载体的构建方法。

背景技术

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，又称血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，于1983年由Senger等人最先发现。现有研究发现VEGF基因的主要生物学功能为刺激血管内皮细胞增殖，诱导血管形成；增加血管内皮细胞的间隙，提高血管通透性。VEGF基因的表达是普遍的，广泛分布于人和动物的脑、肾、皮肤、眼睛等多种组织器官。与此相反，VEGF的两个主要受体VEGFR1和VEGFR2的表达是高度受限的，特异性表达于血管内皮细胞。VEGF主要通过与血管内皮细胞上的特异受体相互作用发挥其生物学功能。

血管异常增生是视网膜血管性疾病(如糖尿病视网膜病变，增生性玻璃体视网膜病变等)发生的重要病理基础，VEGF作为强有效的血管生成调节因子在其中起到关键性的调节作用，疾病发生部位VEGF表达水平明显上升。目前对VEGF在视网膜疾病中的研究多采用VEGF抗体或VEGF受体的拮抗剂，降低VEGF基因表达水平。但是该治疗方法的缺点是抗VEGF的药物可以经由血液循环到达全身，由于涉及机体各组织器官，难以区分VEGF在其中起直接作用还是间接作用，增加了分析VEGF基因功能的难度。为了能够深入研究视网膜疾病中VEGF基因的功能，本发明特构建视网膜专一性VEGF基因表达下调载体，以实现组织专一性VEGF基因表达调节，为深入探究VEGF基因功能提供基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织专一性VEGF表达下调载体的构建方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明将视网膜专一性启动子HB序列和四环素调控转录沉默子tetR-Krab序列依次插入到哺乳动物细胞表达载体pCAGGS中，构建专一性下调视网膜VEGF基因表达的转录沉默子表达载体，实现组织专一性VEGF基因表达调节，为深入探究VEGF基因功能提供基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种组织专一性VEGF表达下调载体的构建方法，包括将组织专一性启动子和四环素调控转录沉默子依次插入至表达载体中的步骤。

进一步地，具体步骤为：

分别PCR扩增得组织专一性启动子HB片段和四环素调控转录沉默子tetR-Krab片段，将tetR-Krab片段连接至pCAGGS表达载体，获得pCAGGS-tetR-Krab重组质粒，之后与HB片段连接，得到组织专一性VEGF表达下调载体pCAGGS-HB-tetR-Krab。

进一步地，所述组织专一性VEGF表达下调载体为视网膜专一性VEGF表达下调载体。

进一步地，所述组织专一性启动子HB片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述四环素调控转录沉默子tetR-Krab片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供一种所述的构建方法获得的组织专一性VEGF表达下调载体。

本发明还提供一种所述的组织专一性VEGF表达下调载体在制备组织专一性下调VEGF基因表达的动物模型中的应用。

本发明公开了以下技术效果：