[发明专利]苹果休眠芽段超低温保存及复苏活力快速检测方法

说明书

本发明公开了苹果休眠芽段超低温保存及复苏活力快速检测方法，包括包括获取休眠枝条条件、干燥处理条件、密封包装、程序降温条件、液氮保存、低温化冻条件、回湿条件、快速存活检测。本发明一种苹果休眠芽段的超低温保存后存活率可达86％。表明该方法是一种安全、可靠、简单有效的保存苹果种质资源的方法，它避免了田间圃位保存易受自然灾害影响而导致种质丢失或毁灭，减少了组织培养保存过程中长期频繁的继代培养人力和物力投入，以及材料遗传性变异和由于人为的原因造成的材料损失的可能性，是苹果种质资源离体长期保存的一条有效途径。

技术领域

本发明涉及农业技术领域，特别涉及苹果休眠芽段超低温保存及复苏活力快速检测方法。

背景技术

苹果是我国重要的无性繁殖作物种质资源。我国是苹果属植物起源中心之一，苹果种质资源极为丰富。苹果属于蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)，主要分布于北温带，包括亚洲、欧洲和北美洲。全世界苹果属植物约有35个种，我国原产27个种，其中野生种21个，栽培种6个。苹果种质资源是苹果研究、生产和育种的物质基础，开展苹果种质资源研究，对了解苹果属植物起源、演化及利用研究具有重要意义。

苹果种质资源保存，一般采取田间圃位方式，实现苹果种质繁殖更新、保存、鉴定、评价和分发，目前是国内外苹果种质资源保存的重要方式。种质资源圃需要栽植保存，可以随时观察种质的植物学特性，但是保存的种质容易受到环境的影响，而且占地面积大，需要大量的人力物力，管理费用较高。试管苗保存期相对较短，保存的材料需要定期组织继代，若管理不善易发生污染。

超低温保存技术是利用液氮(-196℃)的条件来保存植物细胞、组织或者器官，经过处理的植物材料仍然具有正常的细胞活性、全能性和遗传稳定性，以此来达到长期保存植物种质资源的目的。在这个温度下，植物活细胞内的物质代谢和生命活动几乎完全停止，生命物质处于非常稳定的生物学状态。利用该方法在空间和时间上占比都相对较少，且能较好的维持植物活性。此技术具有长期性和稳定性。

根据种质特性及采用的外植体材料，每种作物进行超低温保存时需进行超低温保存技术体系的优化，以提高超低温保存后的存活和再生率；且品种间差异较大，国际上尚未建立起具有普适性的超低温保存方法，是超低温保存技术实际应用中的一个主要瓶颈。本发明通过干燥、密封包装、程序降温、投入液氮气相中保存、低温化冻、回湿等一系列整体处理流程，可实现液氮超低温保存。

休眠芽段活力快速染色，以往多数研究仅关注休眠芽的茎尖染色情况。在进行嫁接时，形成层对促进嫁接口愈合发育、沟通疏导组织、使营养物质能够相互传导起到重要作用。休眠芽段的存活再生与茎尖活力和形成层活力均相关。通过对休眠芽茎尖和休眠芽段形成层进行染色快速存活检测，可实现液氮超低温保存存活再生快速综合判断。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用干燥-程序降温法进行苹果休眠芽段的超低温保存及复苏活力快速检测方法。将苹果休眠芽段进行干燥至含水量30％～45％，经程序降温处理、冻存、化冻、回湿等步骤，获得较高存活率。采用本发明提供的方法，苹果休眠芽段超低温保存后平均存活率最高可达86％。本发明提供的苹果休眠芽段的超低温保存方法程序简单，易于操作，冻存效果好，是苹果种质资源离体长期保存的一条有效途径。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：苹果休眠芽段超低温保存及复苏活力快速检测方法，包括以下步骤：

1)获取休眠枝条；

2)剪成休眠芽段，选取健康休眠枝条的中部条段，剪成带有1个芽，长3～5cm长的节段；

3)对枝条进行干燥处理；

4)将干燥处理后的芽段用热缩管进行密封包装；

5)密封包装后进行降温处理；

6)投入液氮气相中保存；

7)将装有干燥芽段的热缩管从液氮气相中取出，在4℃化冻1天；